Obtenção de neolignanas com atividade antimicobacteriana

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 005288 1 A2
  • Data do depósito:
  • 09/03/2012
  • Data da publicação:
  • 29/10/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 31/04
    Antiinfecciosos, i.e. antibi?ticos, antiss?pticos, quimioterap?uticos; / Agentes antibacterianos;
    ;
    C07C 41/34
    Prepara??o de ?teres; Prepara??o de compostos contendo grupos , grupos ou grupos ; / Prepara??o de ?teres; / Separa??o; Purifica??o; Estabiliza??o; Uso de aditivos;
    ;

OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA. A PRESENTE INVENÇÃO DE PATENTE REFERE-SE À OBTENÇÃO E USO FARMACOLÓGICO DE NEOLIGNANAS (EUPOMATENÓIDE-3, EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO), SEUS DERIVADOS (EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO METILADOS; E EUPOMATENÓIDE-5, CONOCARPANO E EUPOMATENÓIDE-3 HIDROGENADOS) DE FOLHAS DE PIPER REGNELLIIVAR. PALLESCENS (PIPERACEAE) PARA ALICAÇÃOCOM EFICÁCIA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS CAUSADAS POR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (ANIMAL OU HUMANA), ASSOCIADAS OU NÃO À SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (HIV), SENDO PORTANTO APLICÁVEL NO SETOR FARMACÊUTICO. A OBTENÇÃO DAS NEOLIGNANAS DE FOLHAS DE PIPER REGNELLII É REALIZADA PELA TENOLOGIA DE FLUÍDO SUPERCRÍTICO, UTILIZANDO CO2 UMA METODOLOGIA QUE É RÁPIDA, NÃO AGRIDE O MEIO AMBIENTE', NÃO GERA COMPOSTOS COM RESÍDUOS DE SOLVENTE ORGNICO E CONSEGUE OBTER TODAS AS NEOLIGNANAS DE INTERESSE NESTE INVENTO (EUPOMATENÓIDE-3, EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO).

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Documento

OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA Introdução

A presente invenção refere-se à “OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA", ou mais particularmente à obtenção de neolignanas (eupomatenóide-3 - Figura 1, eupomatenóide-5 - Figura 2 e conocarpano - Figura 3) e seus derivados (eupomatenóide-5 e conocarpano metilados; e eupomatenóide-5, conocarpano e eupomatenóide-3 hidrogenados) de folhas de Piper regnellii var. pallescens (Piperaceae) para aplicação com eficácia no tratamento de doenças causadas por Mycobacterium tuberculosis.

Sabe-se que a tuberculose é uma doença infecto-contagiosa conhecida há séculos e quase foi erradicada em países desenvolvidos com estratégias eficientes de combate à doença. Porém, continua sendo um importante problema de saúde pública que ressurge no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Acomete principalmente pessoas na faixa etária correspondente a plena capacidade produtiva, afetando os setores de mais baixa renda da população, vindo a acarretar enorme prejuízo econômico ao país.

Os fatores que intensificaram o crescimento desta enfermidade foram o surgimento, na década de 80, da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), a deterioração das condições sócio-econômicas com piora das condições sociais, a facilidade de movimentos migratórios, as deficiências das instituições de saúde e o aumento dos casos resistentes às drogas antituberculosas.

Estima-se que ocorreram mundialmente 8,8 milhões de casos novos no ano de 2010 (128/100.000) que levou a aproximadamente 1,4 milhões de óbitos/ano.

O Brasil encontra-se entre os 22 países (17° lugar) que concentram 80% dos casos estimados de tuberculose no mundo. Foram notificados 81.946 casos novos em 2011. A incidência da doença é de 43/100.000 habitantes.

A tuberculose é um desafio para a saúde pública, principalmente devido às dificuldades encontradas para o diagnóstico da doença ou até mesmo para identificar os enfermos que não procuram a rede básica de saúde. Por outro lado, mesmo considerando os casos identificados, observa-se um retardo no diagnóstico da doença e no início do tratamento, o que aumenta o tempo de propagação do bacilo pelo seu portador. Rifampicina e isoniazida são os fármacos mais potentes utilizados no tratamento da tuberculose, podendo eliminar mais de 99% dos bacilos nos dois primeiros meses de tratamento.

A utilização de plantas com ação medicinal é uma das alternativas mais antigas de tratamento farmacoiógico existentes. A utilização de fitoterápicos como recurso terapêutico vem crescendo mundialmente, porém, a principal dificuldade na aceitação destes produtos está voltada para a comprovação de sua qualidade, eficácia e segurança. Cabe ressaltar que na Europa concentra-se o maior nicho de comercialização de produtos fitoterápicos, que já são estudados há bastante tempo.

É um objetivo da presente invenção a utilização de neolig nanas no tratamento da tuberculose, que é uma das classes de substâncias encontradas em espécies de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens com atividades biológicas, inclusive antimicrobianas.

Tal problema é resolvido, de acordo com a presente invenção, em um processo que utiliza o C02 como fluido supercrítico na extração de neolignanas de folhas de Piper regnellii var. pallescens, que apresentaram excelente atividade frente a Mycobacteríum tuberculosis.

P. regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.) Yunck apresenta como sínonímia científica Schilleria populifoia Kunth, P. populifolium Kunth, P. kunthianum Steud., Artanthe populifolia Miq., P, pallescens C. DC. e P. flêbellinerve C. DC. É popularmente conhecida como caapeba, capeba ou pariparoba, nome comum para várias espécies de Piper L.

A pariparoba é utilizada no tratamento das obstruções do fígado e do baço, para cicatrização de feridas, redução de inchaços e irritações de pele. As partes da pariparoba também são utilizadas pela medicina popular como antiblenorrágicas, desobstruentes, diuréticas, emolientes, além de ação na pleurite.

Espécies de Piper L. têm sido investigadas quimicamente e ênfase especial é dada às diferentes classes de substâncias que apresentam atividades biológicas. Das várias substâncias isoladas podem-se destacar os alcalóides, compostos fenólicos, lignanas, neolignanas, flavonóides, terpenos e esteróides. Alguns autores, estudando a atividade antibacteriana de plantas colombianas, verificaram atividade de folhas de Piper sp. e da madeira de Piper hispidum frente às micobactérias. Outros pesquisadores também encontraram moléculas ativas de plantas do gênero Piper frente ao Mycobacterium tuberculosis, tais como a piperina {CIM 50 pg/mL), a 5,6-dehidro-7,8-dihidromtisticina (CIM 4 pg/mL), o 2-oxo-14-(3’,4’-metilhendioxifenil) teradecano (CIM 6,25 pg/mL).

O dióxido de carbono é um solvente empregado na extração de produtos naturais por ser atóxico, não carcinogênico, não inflamável, além de não ser prejudicial à saúde quando inalado em baixas concentrações. A temperatura crítica do C02 é outro fator importante, pois permite facilidade nas operações, sendo prontamente obtida (31°C), além de não degradar substâncias (termossensíveis e voláteis). A metodologia de extração por fluido supercrítico é considerada uma tecnologia limpa, pois não gera resíduos tóxicos, sendo, portanto, ambientalmente correta.

Buscas de anterioridade realizadas revelam a existência de patentes análogas, contudo, existem divergências em alguns pontos. A PI 0600679-5, “Uso de neolignanas, seus derivados e análogos, composição e seu processo de obtenção no tratamento de doenças causadas por micobactérias e micobactérias atípicas”, refere-se à utilização de micropartículas poliméricas contendo neolignanas (surinamensina e virolina) isoladas de folhas de Vírola surinaminensis e difere do presente invento por se tratar de uma planta distinta ('Virola surinaminensis), sendo que a deste invento refere-se à Piper regneliii. Outra diferença são as lignanas (surinamensina e virolina), ou seja, neolignanas diferentes das obtidas neste invento (eupomatenóide-3 - Figura 1, eupomatenóide-5 - Figura 2 e conocarpano - Figura 3).

A WO 2009082794 (A1), “Plant extracts with antimicrobial neolignans, their composition and process for extract production”, refere-se às neolignanas obtidas do fruto de Viroia com atividade antifúngica. Esta patente difere do presente invento por se tratar de uma planta distinta (Viroia molissima) à do nosso invento, Piper regneliii. Outra diferença é a atividade antimicrobiana, sendo que a patente já depositada se refere à atividade antifúngica e a do presente invento à atividade antimicobacteriana (Mycobacterium tuberculosis).

A RU 2196599 (C2), "Pharmaceutical and cosmetic compositions with antibacteria! activity”, difere do presente invento em relação às plantas, pois aquela refere-se às Krameria e Mesua ferrea e esta à Piper regneliii. Outra diferença é a substância isolada, a neolignana eupomatenóide-6, uma vez que no presente invento as neolignanas são eupomatenóide-3 (Figura 1), eupomatenóide-5 (Figura 2) e conocarpano (Figura 3).

A CN 1785384, “Chinese medicai composition for treating tuberculosis and its preparation method”, refere-se a nove plantas, incluindo raiz de Astragalus e de Chinese angélica. Apesar de ter o mesmo uso, as plantas utilizadas são diferentes de Piper regneliii (planta do presente invento). O método de extração utilizado na patente também é por fluido supercrítico, mas a extração é de óleos voláteis, e a do presente invento a extração é de neolignanas (eupomatenóide-3 - Figura 1, eupomatenóide-5 - Figura 2 e conocarpano - Figura 3).

Assim, no presente invento são descritas as substâncias puras eupomatenóide-3 (2-(4,,5,-metilenodioxifenil)-3-metiI-5-(£)-propenilbenzofurano (Figura 1); eupomatenóide-5 (2-(4’-hidroxi-5’-rnetoxifenil)-3-metil-5-(E)-propenilbenzofurano) (Figura 2) e conocarpano (2R, 3R)-4’-hidroxifenÍI-3-metil-5-(E)-propenilbenzofurano (Figura 3). Estas substâncias foram identificadas por métodos espectroscópicos e dados da literatura, sendo que os resultados de ressonância magnética nuclear (RMN) são descritos na Tabela 1 (eupomatenóide 3), Tabela 2 (eupomatenóide 5) e Tabela 3 (conocarpano).

Tabela 1: Dados de RMN-1H (300 MHz) em CDCI3 e correlações observadas no 1H x 1H-COSY (300 MHz) da substância eupomatenóide-3, comparados com os valores de deslocamento químico de hidrogênio a 500

MHz em CDCI3, descritos na literatura (MAXWELL et aL, 1999)*.

H

Eupomatenóide-3

ÔH

Eupomatenóide-3 1H x ^-COSY

Eupomatenóide-3

(MAXWELL et al., 1999)

4

7,41 (cf; 1,5)

H-6

7,42 (d; 1,7)

6

7,27 (dd; 8,7; 1,5)

H-4

7,27 (dd; 8,6; 1,7)

7

7,35 (d; 8,7)

H-6

7,35 (d; 8,6)

8

6,51 (dd; 15,9; 1,8)

H-9, H-10

6,52 (dq; 15,5; 1,7)

9

6,21 (dq; 15,9;6,6)

H-8, H-10

6,22 (dq; 15,5; 6,7)

2

7,28 (dd; 8,7; 1,5)

H-3’

7,28 (dd; 8,8; 1,0)

3’

6,90 (d; 8,7)

H-2’

6,91 (d; 8,8)

6

7,26; s

7,27; s

CH3-3

2,40; s

2,.42; s

CH3-IO

1,90 (dd; 6,6; 1,8)

H-8, H-9

1,95 (dd; 7,0; 1,7)

-OCH2O-

6,00; s

-

6,02; s

5 ‘Deslocamentos químicos em ppm (Ôh) e constantes de acoplamento (J, entre parênteses) em Hz.

Tabela 2. Dados de RMN-1H (300 MHz) em CDCI3 e correlações observadas no 1H x 1H-COSY (400 MHz) da substância eupomatenóide-5, comparados com os valores de deslocamentos químicos de hidrogênio a 300 10 MHz em CDCI3, descritos na literatura (CHAURET et al., 1996)*.

H

Eupomatenóide-5

ÔH

Eupomatenóide-5 1H x 1H-COSY

Eupomatenóide-5

(CHAURET et al., 1996)

2

7,29 (dd; 8,1; 1,8)

H-3’

7,27 (dd; 8,2; 1,9)

3’

7,03 (d; 8,1)

H2'

7,00 (d; 8,2)

4

7,43 (d; 1,8)

H-6

7,42 (d; 1,8)

6

7,27 (dd; 8,4; 1,8)

H-4, H-7

7,26 (dd; 8,6; 1,8)

6

7,32 (d; 1,8)

-

7,31 (d; 1,9)

7

7,37 (d; 8,4)

H-6

7,36 (d; 8,6)

8

6,52 (dd; 15,9; 1,8)

H-9, H-10

6,50 (dd; 15,7; 1,7)

9

6,23 (dq; 15,6; 6,6)

H-8, H-10

6,22 (dq; 15,7; 6,5)

CHs-3

2,43; s

2,41; s

CH3-IO

1,90 (dd; 6,6; 1,8)

H-8, H-9

1,89 (dd; 6,5; 1,7)

CH3O-5

3,98; s

-

3,97; s

OH

5,75; s

*Deslocamentos químicos em ppm (Sh) e constantes de acoplamento (J, entre parênteses) em Hz.

Tabela 3: Dados de RMN-1H (300 MHz) em CDCl3 e correlações observadas no 1H x 1H-COSY (300 MHz) da substância conocarpano, 5 comparados com os valores de deslocamentos químicos de hidrogênio a 300

MHz em CDCI3, descritos na literatura (CHAURET et al., 1996)*.

H

Conocarpano

Sh

Conocarpano 1H x 1H-COSY

Conocarpano

(CHAURET et al., 1996)

2

5,08 (d; 9,0)

H-3

5,09 (d; 8,8)

2!

7,30 (d; 8,7)

H-3'

7,30 (d; 8,5)

3

3,39 (dq\ 9,0; 6,9)

H-2

3,40; (quit; 7,3)

3’

6,83 (d; 8,7)

H-2’

6,83 (d; 8,5)

4

7,10; st

7,14; s

5’

6,83 (d; 8,7)

H-6’

6,83 (d; 8,5)

6

7,12 (d; 8,1)

H-7

7,13 (d; 8,2)

6’

7,30 (d; 8,7)

H-5’

7,30 (d; 8,5)

7

6,76 (d; 8,1)

H-6

6,77 (d; 8,2)

8

6,36 (dd; 15,6; 1,5)

H-9, H-10

6,37 (dd; 15,7; 1,5)

9

6,11 (dqr; 15,6; 6,6)

H-8, H-10

6,45 (dq; 15,7; 1,5)

CH3-3

1,39 (d; 6,9)

H-3

1,40 (d; 6,8)

CH3-10

1,86 (dd; 6,6; 1,5)

H-8, H-9

1,87 (dd; 6,5; 1,5)

OH

4,98; s

-

-

‘Deslocamentos químicos em ppm (Sh) e constantes de acoplamento (J, entre

parênteses) em Hz.

O interesse por drogas derivadas de plantas, sobretudo a busca por 10 novos princípios ativos e o interesse nos estudos dos compostos naturais ativos como modelo para síntese de substâncias análogas mais potentes e seletivas, que podem ser obtidas mais facilmente e talvez a custos menores, tem motivado muitas indústrias farmacêuticas a investir em estudos envolvendo plantas.

15    Na antibioticoterapia da tuberculose, são utilizadas as drogas de

primeira linha bactericidas e/ou bacteriostáticas como isoniazida, etambutol, pirazinamida e rifampicina, drogas estas descobertas há mais de 50 anos. Alguns fármacos como a pirazinamida são ineficazes contra tubercuíose-multidrogas-resistente (TB-MDR) ou tuberculose-extensivamente-drogas-20    resistente (TB-XDR), além de ter interação medicamentosa com anti-

retrovirais, o que compromete a eficácia do tratamento de pacientes co-infectados com HIV.

Fármacos de segunda linha como estreptomicina e etionamida são usados quando os medicamentos de primeira linha não são efetivos. A atividade destes fármacos contra a bactéria da tuberculose foi descoberta ao acaso, empregando estratégias de pesquisa de novos fármacos.

Há, portanto, a necessidade de novos agentes antimicobacterianos que reduzam a duração no tratamento, ativos contra cepas resistentes, não interferiram com anti-retrovirais e tenham atividade contra bacilos em latência.

Considerando as concentrações inibitórias mínimas (CIM) de alguns fármacos de primeira linha utilizados no tratamento da tuberculose, como a isoniazida, ClM=(0,02-0,05 pg/mL), rifampicina, CIM=(0,1-0,2 pg/mL) e pirazinamida, CIM = 50 pg/mL (pH 5,5), a atividade das substâncias puras e derivados de folhas de P. regnellii var. pallescens foram muito significativas frente a Mycobacterium tuberculosis (Tabela 4) e devem ser valorizadas, já que faz mais de 50 anos que não são lançados novos fármacos com ação antimicobacteriana.

Assim, como vantagens do presente invento, podem-se destacar:

•    Nem sempre a indústria farmacêutica consegue sintetizar produtos oriundos de plantas. Por isso, o isolamento de neolignanas a partir de folhas de Piper regnellii produz um bom rendimento, com consequente aproveitamento pela indústria farmacêutica;

•    Eficiência do uso destas neolignanas no tratamento da tuberculose, especialmente o eupomatenóíde-5 (Figura 2), que apresentou concentração inibitória mínima de 1,9 pg/mL e índice de seletividade alto (Tabela 4);

•    O índice de seletividade (igual a 20) (Tabela 4) da substância eupomatenóide-5 (Figura 2) indica que a ação antimicobacteriana tem especificidade pelo patógeno, ou seja, ausência ou pequena toxicidade para o hospedeiro;

•    Os medicamentos de primeira e segunda linha para tuberculose são de origem sintética e este, de origem natural;

•    O processo de extração de neolignanas de folhas da espécie vegetal Piper regnellii var. pallescens, pelo fluido supercrítico, gera produtos livres de resíduos tóxicos (resíduos de solventes orgânicos);

•    O processo de extração de neolignanas de folhas da espécie vegetal Piper regnellii var. pallescens, pelo fluido supercrítico, é uma tecnologia limpa, que não agride o meio ambiente.

Somando-se as vantagens acima, é possível verificar a relevante eficiência do invento, pois a obtenção das neolignanas de folhas de Piper regnellii é realizada pela tecnologia de fluido supercrítico, uma metodologia que é rápida, não agride o meio ambiente, não gera compostos com resíduos de solvente orgânico e consegue obter todas as neolignanas de interesse neste invento (eupomatenóide-3 - Figura 1, eupomatenóide-5 - Figura 2, e conocarpano - Figura 3).

Descrição das Figuras

Para melhor compreensão do objeto da presente patente, far-se-ão referências aos desenhos anexos, em que:

A    Figura    1    ilustra    a    2-(4',5’-metilenodioxifenil)-3-metil-5-(E)-

propenilbenzofurano (estrutura química do eupomatenóide-3).

A Figura 2 representa a 2-(4’-hidroxi-5'-metoxifenil)-3-metil-5-(E)-propenilbenzofurano (estrutura química do eupomatenóide-5).