Obtenção de neolignanas com atividade antimicobacteriana

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 005288 1 A2
  • Data do depósito:
  • 09/03/2012
  • Data da publicação:
  • 29/10/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 31/04
    Antiinfecciosos, i.e. antibi?ticos, antiss?pticos, quimioterap?uticos; / Agentes antibacterianos;
    ;
    C07C 41/34
    Prepara??o de ?teres; Prepara??o de compostos contendo grupos , grupos ou grupos ; / Prepara??o de ?teres; / Separa??o; Purifica??o; Estabiliza??o; Uso de aditivos;
    ;

OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA. A PRESENTE INVENÇÃO DE PATENTE REFERE-SE À OBTENÇÃO E USO FARMACOLÓGICO DE NEOLIGNANAS (EUPOMATENÓIDE-3, EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO), SEUS DERIVADOS (EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO METILADOS; E EUPOMATENÓIDE-5, CONOCARPANO E EUPOMATENÓIDE-3 HIDROGENADOS) DE FOLHAS DE PIPER REGNELLIIVAR. PALLESCENS (PIPERACEAE) PARA ALICAÇÃOCOM EFICÁCIA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS CAUSADAS POR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (ANIMAL OU HUMANA), ASSOCIADAS OU NÃO À SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (HIV), SENDO PORTANTO APLICÁVEL NO SETOR FARMACÊUTICO. A OBTENÇÃO DAS NEOLIGNANAS DE FOLHAS DE PIPER REGNELLII É REALIZADA PELA TENOLOGIA DE FLUÍDO SUPERCRÍTICO, UTILIZANDO CO2 UMA METODOLOGIA QUE É RÁPIDA, NÃO AGRIDE O MEIO AMBIENTE', NÃO GERA COMPOSTOS COM RESÍDUOS DE SOLVENTE ORGNICO E CONSEGUE OBTER TODAS AS NEOLIGNANAS DE INTERESSE NESTE INVENTO (EUPOMATENÓIDE-3, EUPOMATENÓIDE-5 E CONOCARPANO).

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Documento

A    Figura    3    mostra    a    (2R, 3R)-4’-hidroxifenil-3-metil-5-(E)-

propenilbenzofurano (estrutura química do conocarpano).

Descrição Detalhada do Invento

No presente invento, OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA, são descritas as substâncias puras eupomatenóide-3 (2-(4’,5’-metilenodioxifenil)-3-metil-5-(E)-propenilbenzofurano (Tabela 1 e Figura 1); eupomatenóide-5 (2-(4,-hidroxi-5’-metoxifenil)-3-metil-5-(£)-propenilbenzofurano) (Tabela 2 e Figura 2) e conocarpano (2R, 3R)-4'-hidroxifenil-3-metil-5-(E)-propenilbenzofurano (Tabela 3 e Figura 3),

DIÁRIO DE LABORATÓRIO Análise espectrométrica

Para a análise espectrométrica das substâncias puras são realizadas as seguintes técnicas: espectrometrias de massas, espectrometria de absorção na região do infravermelho (IV) e ultravioleta (UV), ressonâncias magnéticas nucleares (RMN) unidimensionais de 1H, 13C, DEPT e bidimensionais de COSY, HETCOR, HETLR. É utilizado o solvente deuterado CDCi3 e como referência interna o TMS (ô=0,0 ppm).

Análise cromatográfica

As cromatografias são realizadas em colunas de vidro, utilizando-se sílica gel 60 (70 a 230 mesh ASTM), e na cromatografia no modo fiash, sílica gel 60 (230 a 400 mesh ASTM). Nas cromatografias em camada delgada (CCD) utilizam-se sílica gel 60 GF254, que são reveladas com solução de vanilina sulfúrica a 2%.

Extração supercrítica

A extração supercrítica é realizada em uma unidade de escala laboratorial, composta de um cilindro de C02, dois banhos termostatizados, uma bomba seringa e um extrator com volume interno de aproximadamente 170 mL (diâmetro do leito é de 2,85 cm e a altura do leito é de 26,1 cm). São empregadas as seguintes condições: pressão: 244,1 bar, temperatura: 60°C, densidade do C02: 0,78g/mL e uma vazão volumétrica constante para o líquido extrator: 3mL/min, sendo utilizado como tempo de extração 280 minutos. O leito é alimentado com aproximadamente 35g de folhas de Piper regnellü. Para a formação do leito, o material vegetal triturado é acomodado uniformemente na parte inferior do extrator. Na saída do extrator, devido à despressurização, ocorre a separação do extrato do solvente e então a massa extraída é coletada em um recipiente de vidro âmbar. O rendimento foi de 2,38%.

O extrato coletado é submetido à coluna cromatográfica empacotado com hexano e eluído com hexano, hexano/clorofórmio 98:2, hexano/clorofórmio 90:10, hexano/clorofórmio 50:50, clorofórmio, acetato de etila e metanol.

As frações são cromatografadas em CCD e as que apresentaram semelhanças cromatográficas são reunidas e identificadas por RMN de 1H. Duas substâncias puras são separadas e identificadas nesta coluna cromatográfica (eupomatenóide-5 — Figura 2 e conocarpano - Figura 3).

Para o isolamento da substância eupomatenóide-3 (Figura 1) é realizada nova coluna cromatográfica no modo flash.

Determinação da concentração inibitória mínima

As neolignanas e seus derivados são submetidos ao ensaio in vitro para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) capaz de inibir a multiplicação bacilar em Mycobacteríum tuberculosis H37RV. Para tal, é empregada a metodologia REMA (resazurin microtiter assay plate) em uma microplaca estéril de 96 orifícios. A substância pura é diluída em Dimetilsulfóxido (DMSO) para se obter soluções de 1.000 pg/mL. Em seguida são realizadas diluições desta solução no meio Middlebrook 7H9 com OADC, de maneira a se obter concentrações das substância puras (250 a 1,95 pg/mL). A solução do fármaco padrão (isoniazida) é preparada inicialmente a 4.000 pg/mL em água deionizada estéril, seguida de diluições em Middlebrook 7H9 com OADC para obter uma concentração de trabalho inicial de 4 pg/mL. As concentrações do fármaco padrão a serem estudadas são de 1,0 a 0,007pg/mL após a adição do inóculo bacteriano nos orifícios da placa. Estas diluições são realizadas diretamente na microplaca utilizando diluições sucessivas. A cepa de Mycobacteríum tuberculosis H37Rv é previamente cultivada em Middlebrook 7H9 com OADC, a 35°C, e é padronizada até atingir a turvação igual à escala n° 1 de McFarland. As culturas são diluídas 25 vezes e 100pL da diluição são inoculados em cada um dos orifícios contendo as substâncias. As microplacas são seladas com tampa transparente e incubadas a 35 °C por sete dias. Após este período, são adicionados 30 pL de solução de Resazurina (0,01% p/v) em todos os orifícios da microplaca semeados. As placas são re-incubadas por mais 24 horas a 35°C e é realizada a leitura final. A manutenção da cor azul nos orifícios é interpretada como ausência de crescimento bacteriano e 0 desenvolvimento de cor rósea como de multiplicação bacilar. As placas que apresentaram orifícios violeta são re-incubadas por mais 24 horas, e se houver alteração de cor para róseo, é considerado positivo para crescimento bacteriano. Caso persistir a cor inicial, o resultado é considerado negativo. A concentração inibitória mínima é definida como a menor concentração da droga capaz de impedir a mudança de cor de azul para róseo, ou seja, presença de viabilidade bacilar.

Ensaio de citotoxicidade em macrófagos J774G8

Para verificar a toxicidade dos extratos e das substâncias puras são utilizados macrófagos de linhagem contínua J774G8. O experimento é realizado em placas de 96 poços, onde são adicionados 5x10macrófagos/poço e então incubados com RPMI-1640 pH 7,2, suplementado com 10% de soro fetal bovino por 24 horas a 37°C e sob tensão de 5% de COpara haver a formação de uma monocamada confluente de células. Após a formação da monocamada de células, é retirado o meio colocado no dia anterior e são adicionadas 100pL de meio de cultura contendo neolignanas em concentrações inferiores a 1000 pg/mL. Após 48 horas de incubação em estufa a 37 °C e sob tensão de 5% de C02, as células viáveis são quantificadas pelo método colorimétrico da sulforrodamina B. Para proceder a quantificação, o meio é retirado dos poços e as células que ficam aderidas são fixadas adicionando-se 50 pL/poço de ácido tricloroacético 10%, sendo a microplaca mantida por 1 hora a 4 °C. Após, os poços são lavados em água corrente e são adicionados 50 pL/poço de sulforrodamina B (0,4% p/v em solução de ácido acético 1%), sendo a microplaca protegida da luz e mantida por 30 minutos a 4°C. Logo após, os poços são lavados com solução de ácido acético a 1% e adicionados 150 pL/poço de Trisbase 10 mM. A microplaca é agitada e a leitura procedida com o auxílio de um leitor de Elisa, em comprimento de onda de 530 nm. Como parâmetro de comparação, é preparado um branco contendo somente meio de cultura RPMl 1640, um controle de células sem adição da substância e um controle de células com a adição de pequenos volumes de DMSO utilizados para solubilizar a substância testada, onde a maior concentração utilizada não ultrapassa 1,0% (v/v). Este experimento é realizado três vezes em quadruplicata.

Determinação do índice de seletividade

O índice de seletividade (IS) é definido a partir da razão dos valores de CC50 (concentração citotóxica para 50% dos macrófagos - obtida do ensaio de citotoxicidade) sobre a concentração inibitória mínima (CiM) ([S=CC50/CIM). Os valores que são superiores a 10 indicam ação antimicobacteriana com especificidade pelo patógeno, ou seja, ausência de toxicidade pelo hospedeiro. Reação de metilação das neolignanas

Em um balão de duas bocas adaptado a um sistema de refluxo, contendo uma solução de um equivalente da neolignana em acetona (5 ml_), é adicionado o haleto de alquila (1,5 eq) e K2CO3 (2 eq). Deixa-se o sistema sob refluxo acompanhando a reação por cromatografia até o consumo total do material de partida. O tempo reacional para cada composto varia. O produto é filtrado, concentrado e purificado por cromatografia em coluna no modo flash, utilizando-se como eluente hexano e acetato de etila. Obtém-se assim os produtos metilados que são analisados e identificados por cromatografia gasosa, acoplado com espectro de massa (CG/EM) e por ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H,

Reação de hidrogenação das neolignanas

Em um tubo de micro-ondas com agitador magnético, coloca-se a substância com 1 mL de metanol. Adiciona-se Pd/C (Paládio sob carvão ativo) a 10% e CHO2NH4 (Formiato de Amônio). Esta solução é colocada em um tubo de ultrassom e posteriormente sob atmosfera de Nitrogênio, o qual é colocado no micro-ondas a 60°C por 2 minutos. A reação é filtrada sob vácuo em um funil com placa sinterizada. É feito CCD do produto da reação e a cromatoplaca é visualizada através de radiação UV, e após, a revelação com reativo de Godan. Os produtos hidrogenados são purificados em coluna cromatográfica no modo flash e analisados e identificados por cromatografia gasosa, acoplado com espectro de massa (CG/EM) e por ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H.

Resultados obtidos

Neste invento, são produzidos extratos brutos e frações de Piper regnellii var. pallescens e a atividade antimicobacteriana é testada pelo método resazurín microtiter assay plate (REMA). Os resultados encontrados para os 5 ensaios são muito satisfatórios, uma vez que estes demonstraram acentuada atividade antimicobacteriana, que são listadas na Tabela 4.

Tabela 4. Atividade antimicobacteriana e citotóxica de extratos brutos (caule e folha), substâncias puras isoladas e derivados metilados e

hidrogenados (folhas) de Piper regnellii var. pallescens.

CC5o

DP

CIM pg/mL

IS

Extrato bruto da folha

64,0

4,3

15,1

4,2

Extrato bruto do caule

69,3

14,6

15,1

4,6

Conocarpano

97,6

18,6

15,1

6,5

Conocarpano Metilado

45,3

9,5

7,5

6,0

Conocarpano Hidrogenado

27,3

5,0

31,2

0,9

Eupomatenóide -5

39

4,3

1,9

20,0

Eupomatenóide -5 metilado

35,3

6,4

3,8

9,3

Eupomatenóide -5 hidrogenado

39,5

7,8

7,5

5,3

Eupomatenóide -3

NR

NR

250

NR

Eupomatenóide -3 hidrogenado

23,3

5,8

7,5

3,1

10    CC50: Concentração citotóxica que mata 50% dos macrófagos (J774G8); DP:

Desvio padrão; CIM: Concentração inibitória mínima; IS: índice de seletividade; NR: Não realizado.

Considerando os resultados apresentados, a substância eupomatenóide-5 (Figura 2) apresenta resultado bastante promissor no 15 tratamento da tuberculose, pois a concentração inibitória mínima encontrada em produtos naturais é uma melhores já relatadas, com um índice de seletividade excelente para a substância pura eupomatenóide-S (Tabela 4).

REIVINDICAÇÕES

1.    OBTENÇÃO DE NEOUGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA, caracterizada pelo processo de extração de neolignanas (extrato bruto, eupomatenóide-3, eupomatenóide-5 e conocarpano), capaz de extrair de modo eficiente todas as neolignanas de interesse neste invento, preferencialmente as condições: pressão: 244,1 bar, temperatura: 60°C, densidade do C02: 0,78g/mL e uma vazão voiumétrica constante para o líquido extrator: 3mL/min, sendo utilizado como tempo de extração 280 minutos;

2. OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, caracterizada pelo processo de obtenção de neolignanas (extrato bruto, eupomatenóide-3, eupomatenóide-5 e conocarpano), com emprego da metodologia de extração por fluido supercrítico;

3. OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, caracterizada pelos extratos brutos, substâncias puras e derivados metílados e hidrogenados obtidos de folhas da espécie vegetal Piper regnellii var. pallescens;

4.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo extrato bruto de folhas de Piper regnellii var. pallescens;

5.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pela substância pura eupomatenóide-3 (Figura 1);

6.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pela substância pura eupomatenóide-5 (Figura 2);

7.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pela substância pura conocarpano (Figura 3);

8. OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo derivado eupomatenóide-3 hidrogenado;

9. OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

5    ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3,

caracterizada pelo derivado eupomatenóide-5 hidrogenado e metilado;

10.    OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo derivado conocarpano hidrogenado e metilado;

10    11.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, caracterizada pelo uso de extrato bruto, neolignanas e seus derivados, com ação antimicobacteriana, em especial Mycobacterium tuberculosis, de acordo com as reivindicações 1 a 10;

15    12.    OBTENÇÃO    DE    NEOLIGNANAS    COM    ATIVIDADE

ANTIMICOBACTERIANA, caracterizada pelo uso de neolignanas e seus derivados para manufatura de medicamentos para aplicação na terapêutica antimicobacteriana.

DESENHOS Figura 1


h3c

O ^5

O ^4-


Figura 2


10

H3CCX 5


Figura 3


10



RESUMO

OBTENÇÃO DE NEOLIGNANAS COM ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA

A presente invenção de patente refere-se à obtenção e uso farmacológico 5 de neolignanas (eupomatenóide-3, eupomatenóide-5 e conocarpano), seus derivados (eupomatenóide-5 e conocarpano metilados; e eupomatenóide-5, conocarpano e eupomatenóide-3 hídrogenados) de folhas de Piper regnellii var. paflescens (Piperaceae) para aplicação com eficácia no tratamento de doenças causadas por Mycobacterium tuberculosis (animal ou humana), 10 associadas ou não à síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV), sendo portanto aplicável no setor farmacêutico.

A obtenção das neolignanas de folhas de Piper regnellii é realizada pela tecnologia de fluido supercrítico, utilizando CO2, uma metodologia que é rápida, não agride o meio ambiente’, não gera compostos com resíduos de 15 solvente orgânico e consegue obter todas as neolignanas de interesse neste invento (eupomatenóide-3, eupomatenóide-5 e conocarpano).