Processo de produção de proteína p28 em plantas, e uso da proteína p28 na preparação de vacina contra a artrite encefalite caprina

  • Número do pedido da patente:
  • PI 1106374-2 A2
  • Data do depósito:
  • 20/09/2011
  • Data da publicação:
  • 13/08/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • C07K 1/30
    Processos gerais para preparação de pept?deos; / Extra??o; Separa??o; Purifica??o; / por precipita??o;
    ;
    C12N 15/83
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, prepara??o ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Introdu??o de material gen?tico ex?geno usando vetores; Vetores; Utiliza??o de hospedeiros para os mesmos; Regula??o da express?o; / Vetores ou sistemas de express?o especialmente adaptados a hospedeiros eucariotos; / para c?lulas vegetais; / Vetores virais, p. ex. v?rus do mosaico da couve-flor;
    ;
    C07K 14/155
    Pept?deos tendo mais de 20 amino?cidos; Gastrinas; Somatoestatinas; Melanotropinas; Derivados dos mesmos; / de v?rus; / V?rus de RNA; / Retroviridae, p. ex. v?rus da leucemia bovina, v?rus da leucemia felina, v?rus de leucemia/linfoma da c?lula T humana; / Lentiviridae, p. ex. v?rus da imunodefici?ncia humana (HIV), v?rus visna-maedi, v?rus de anemia infecciosa equina;
    ;

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA P28 EM PLANTAS, E USO DA PROTEÍNA P28 NA PREPARAÇÃO DE VACINA CONTRA A ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA A presente invenção proporciona um vantajoso processo de produção da proteína p28 do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), utilizando o vírus do mosaico do caupi (CPMV) como vetor e sua inoculação em plantas de feijão-de-corda. São também reveladas as condições para o uso da proteína p28 assim obtida na preparação de um imunógeno contra o CAE.

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Documento

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Processo de Produção de Proteína P28 em Plantas, e Uso da Proteína P28 na Preparação de Vacina contra a Artrite

Encefalite Caprina

Campo da Invenção

A presente invenção situa-se no campo da Viroiogia e Biotecnologia. Mais especificamente, a presente invenção revela um processo de produção da proteína p28 do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), utilizando um vetor baseado no Vírus do Mosaico do Caupi (CPMV). É também revelado o uso da proteína p28, produzida em sistema vegetal, como um ímunógeno contra a artrite encefalite caprina (CAE).

Antecedentes da invenção A ENFERMIDADE

A CAE é uma doença disseminada no mundo inteiro e foi reconhecida clinicamente, pela primeira vez, na Suíça, em 1959, por observação de artrite crônica em caprinos adultos (STÜNZI et al. 1964). Esta doença foi descrita pela primeira vez nos Estados Unidos como artrite progressiva em animais adultos e encefalomielite desmielinizante em animais com menos de seis meses (CORK et al., 1974). No Brasil, o primeiro registro sorológico do CAE foi realizado no Rio Grande do Sul (MOOJEN et al., 1986), assim como o isolamento do vírus (HORTZE et al., 1992). Posteriormente, foram registrados casos em São Paulo (GARCIA eí al., 1992), Minas Gerais (ASSIS & GOUVEIA, 1994) e no Rio de Janeiro (CUNHA & NASCIMENTO, 1995). Na região Nordeste foi registrada a ocorrência de animais soropositivos na Bahia (ASSIS, GOUVEIA, 1994), no Ceará (PINHEIRO et al., 1989; ASSIS & GOUVEIA, 1994) e em Pernambuco (CASTRO et al ., 1994). Em Fortaleza, onde se encontra a maior parte da caprinocultura leiteira do Estado do Ceará, estudos epidemiológicos demonstraram uma soroprevalência de 40,7% (MELO, 1996; MELO & FRANKE, 1997). Segundo dados do último levantamento disponível, a soroprevalência aumentou para 57,5% (PINHEIRO et al., 2001).

O VÍRUS

O vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e vírus do Maedi-Visna (MW) são atualmente referidos em conjunto, constituindo o grupo dos ientivírus dos pequenos ruminantes (SRLV) e ambos pertencem ao gênero Lentivirus da família Retroviridae (LEROUX et al., 1997A; PETERHANS et al., 2004). Este grupo compreende vários isolados distribuídos em dois grupos filogeneticamente divididos em CAEV e MW. Estes vírus são conhecidos por causarem, respectivamente, artrite e encefalite vira! em caprinos (artrite-encefalite dos caprinos - CAE) e Maedi-Visna, também conhecida por pneumonia progressiva dos ovinos, ambas doenças de progressão lenta (NARAYAN et al., 1980; PÉTURSSON et al., 1990; STRAUB, 2004).

O gênero Lentivirus inclui ainda o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus da imunodeficiência dos símios (SIV), o vírus da imunodeficiência dos felinos (FIV), o vírus da imunodeficiência dos bovinos (BIV) e o vírus da anemia infecciosa dos eqüinos (EIAV) (PASICK, 1998; ICTVdB, 2006; LEROUX E MORNEX, 2008).

Os SRLV apresentam-se como vírions envelopadas de 80 a 100 nm de diâmetro e uma densidade de 1,13-1,18 g/cm3 (DAHLBERG et al., 1981; ICTVdB, 2006). São constituídos por um core eletro denso, rodeado por um invólucro protéico e elementos da membrana celular do hospedeiro. Transportam duas moléculas pequenas (7-11 Kb) de RNA de cadeia simples com polaridade positiva, em tudo semelhantes ao mRNA celular (HAZIZA et al., 2001; LEROUX E MORNEX, 2008).

O genoma do vírus é constituído por 4 genes principais: 5’-gag-pro-pol-env-3’, comuns a todos os retrovírus.

O gene “gag” (“group-specific-aníigen”) codifica as proteínas da matriz (MA), do capsídeo (CA) e do nucleocapsídeo (NC), originadas a partir de uma proteína precursora denominada Gag (CLEMENTS & ZINK, 1996). A MA situa-se logo abaixo do invólucro vírico ligando-se aos fosfolípidos do invólucro. As 5 proteínas do capsídeo formam um estojo que rodeiam o complexo ribonucléico. Estas proteínas são fortemente antigênicas na maioria dos retrovírus (DING & XIANG, 1997). De acordo com Andrés et al., (2005) e OlE (2008) as proteínas CA corresponde a p28 no CAEV e p25 no MW. A proteína NC é pequena, de caráter básico e está associada ao RNA genômico sendo considerada crucial ío para a encapsidação do genoma viral (LACERENZA et ai., 2008).

O gene “pro” codifica uma protease que cliva os produtos de tradução dos genes gag e pol, com um papel importante na maturação e caráter infeccioso do vírus (CLEMENTS E ZINK, 1996).

O gene “pol” codifica as enzimas transcriptase reversa (RT) e integrase 15    (IN), que intervém, respectivamente, na transcrição inversa do ARN viral em

ADN linear de cadeia dupla e na integração deste nas células do hospedeiro (BERGER et al., 2001; HARE et ai., 2009).

O gene “env” codifica as glicoproteínas do invólucro da superfície (SU ou gp135) e transmembranária (TM), ambas derivadas de um precursor comum 20 - designado Env, tendo como função mediar a adsorção e a fusão do invólucro vírico com a membrana celular, possibilitando a penetração do core nas células-alvo (HULÜNGER et al., 1993).

A TRANSMISSÃO

25    A transmissão do vírus entre os caprinos ocorre, com maior freqüência,

através de monócitos e macrófagos infectados presente principalmente no colostro e leite (ADAMS et al., 1983; ELLIS et al., 1986). O vírus presente no leite pode está em células somáticas mantendo sua infectividade ou ainda livres (SMITH & SHERMAN, 1994). Pode ocorrer também através de contato 3o direto prolongado e/ou por outras fontes contaminantes como sangue, fezes, saliva, lágrimas, além de alimentos contaminados, máquinas de ordenha e

materiais cirúrgicos mal higienizados (ROWE et ai., 1992). A transmissão sexual também é possível devido a presença do vírus no sêmem (TRAVASSOS, et al., 1999).

5 A CLÍNICA

As formas clínicas do CAE não são curáveis e o emprego de medicamentos contribuírem apenas com a melhora clínica temporária (FRANKE, 1998).

10 O TRATAMENTO E A PROFILAXIA

Ainda não existe tratamento e nem vacina para esta enfermidade restando como única medida o controle preventivo (FRANKE, 1998, SOUSA et. al., 2005). Dessa forma, é desejável o desenvolvimento de técnicas para a produção de vacinas de baixo custo que também possam ser utilizadas de 15 forma simples. No entanto, uma das grandes dificuldades para produzir a vacina tem sido a baixa imunogenicidade deste vírus. Trabalhos com esse fim, vêm sendo desenvolvidos utilizando a proteína p28 como modelo uma vez que ela é a mais representativa no capsídeo e a que apresenta maior caráter imunogênico quando comparada as demais proteínas do CAEV (SOUSA et. al., 20    2005).

USO DE VÍRUS DE PLANTA

Dentre as técnicas disponíveis para uma vacina, pesquisadores vêm utilizando, com sucesso, certos vírus que infectam vegetais para expressarem 25 fragmentos de proteínas antigênicas em sua superfície, originando quimeras, que desencadearão uma resposta imunológica (XU, JONES & RODGERS, 1996).

Devido ao fato de ser transmitido mecanicamente, de atingir alta concentração na planta hospedeira, e por ser estável e de fácil purificação, o 30 vírus do mosaico do caupi-CPMV tem sido o vírus vegetal mais utilizado com o

propósito de expressar genes em sua capa protéica. (MESHCHERIAKOVA et al., 2009).

A produção de vacinas em plantas é mais barata que a tecnologia clássica disponível hoje. Além disso, as partículas virais apresentam-se mais 5 estáveis ao ambiente e também ficariam mais expostas ao sistema imunológico do hospedeiro (DORSSERS et al., 1984). isso apresenta uma outra grande vantagem, já que tais vírus não são considerados patógenos e nem veiculam partículas potencialmente infectantes para humanos e animais (MODELSKA et al., 1998).

ío    No âmbito patentário, foram localizados alguns documentos parcialmente

relevantes, que serão descritos a seguir.

O documento WO 98/56933 revela construções de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificadora de uma capa viral protéica de planta (como o peptídeo S do CPMV) contendo um inserío de proteína em que 15 esta capa protéica foi modificada de forma a reduzir a habilidade de atingir o empacotamento de ácidos nucleicos nas partículas virais. A planta Vigna unguiculata é referida com a planta mais adequada para a produção da partícula viral.

O documento US 6,884,623 revela métodos de inserções de vírus de 20 mamíferos em vírus vegetal, que é inoculado em plantas. Um exemplo de vírus vegetal seria o CPMV. O documento revela e reivindica proteínas com de 6 a 21 aminoácidos.

O documento US 5,874,087 revela a inserção de um peptídeo biologicamente ativo em um vírus de planta (em sua capa protéica). O vírus 25 pode ser CPMV e a inserção feita pode ser dos vírus FMDV, HIV e HRV.

Entretanto, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

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Sumário da Invenção

A presente invenção revela um processo de produção da proteína p28 do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), como candidata vacinai desenvolvimento de Kits de diagnóstico. Tal produção é obtida utilizando um sistema vegetal desenvolvido por Liu & Lomonossoff (2002) e Liu et al. (2005). Neste sistema a sequência de cada RNA viral (RNA-1 e RNA-2) do CPMV é inserida entre o promotor 35S do vírus e o códon “nos” íerminador em um plasmídeo (vetor binário). Este vetor gerado pode ser clonado em cepas de Escheríchia coli e/ou Agrobacterium tumefaciens. Os vetores utilizados foram: pBinP-S1NT (Liu e Lomonossoff, 2002) e o pBinP-NS1 RNA-2 (Liu et al., 2005), os quais correspondem aos RNA-1 e RNA-2 do “Virus do Mosaico do Caupi- CPMV”, respectivamente. O pBinP-NS1 RNA-2 contém ainda o gene de expressão da proteína florescente (GFP), inserido entre os sítios das enzimas endonuclease (Apal e StuI).

Vantajosamente, o processo da invenção compreende a produção de proteína p28, sem necessidade da obtenção e uso de plantas transgênicas, utilizando para tanto o CPMV inoculado em plantas Vigna unguiculata L.

Em uma realização preferencial, o processo compreende a etapa adicional de purificação das proteínas obtidas. É um outro objeto da invenção o uso da proteína p28 obtida pelo processo acima para produção de anticorpos específicos contra a CAE e desenvolvimento de Kits para o seu diagnóstico.

A presente invenção mostra a viabilidade da utilização de vírus de planta como vetor de proteína de enfermidade viral de interesse clínico.

É, portanto, um objeto da presente invenção, o processo de produção de proteína P28, compreendendo as etapas de:

a)    desenho dos oligonucleotídeos (primers);

b)    inserção das sequências nucleotídicas do CAEV referente a proteína p28, no genoma do vírus de planta (CPMV);

c)    inoculação do plasmídio de CPMV contendo o inserto viral da p28 em plantas de Vigna unguiculata; e

d)    produção da proteína p28 diretamente nas folhas da referida planta.

Em uma realização preferencial, o processo compreende a etapa adicional de purificação das proteínas obtidas nas folhas.

É outro objeto da invenção o uso da proteína p28 obtida pelo processo acima como imunógeno contra a CAE. Em uma concretização preferencial, a 5 proteína p28 obtida das folhas da referida planta são usadas diretamente como imunógenos protetores contra a CAE.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e também descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a 10 seguir.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica 1-6 inserida no vetor pBinP-15 NS1 RNA-2. Em branco está a sequência da proteína S do vetor (1- 107), em cinza a sequencia do peptideo de divagem (108-173), em amarelo o sitio Apal (174-179) e em preto a sequencia do inserto da p28 (180-630), inicializados pelos oiigonucieotídeos do CAEV 1-6.

A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos traduzidos a partir da 20 sequência de nucleotídeos de CAEV (oligonucleotídeo 1/6).

A Figura 3 revela uma foto mostrando a inoculação de plantas de Vigna unguiculata L., com o vetor pBinP-NS1 RNA-2 contendo o inserto da proteína p28 do Vírus da artrite e encefalite caprina (CAEV).

A Figura 4 revela uma foto da planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-25 corda) mecanicamente infectada com o pBinP-NS1 RNA-2 contendo o inserto da p28 do CAEV, 5 dias após a inoculação do plasmídeo. A planta apresenta os sintomas característicos do vírus CPMV.

A Figura 5 revela a RT-PCR do CAEV amplificado a partir de RNA extraído de folhas de plantas de V.unguiculata sistemicamente infectadas com 30 o plasmídeo contendo: poço 1- marcador; poços 2 e 6- plasmídeo contendo o

inserto da P28; poço-3 CPMV (plasmídeo sem o inserto); poço 4- Piasmídeo pGem com inserto 1/6 de CAEV e poço 5-cDNA do CAEV.

A Figura 6 mostra a Eletroforese SDS-PAGE GEL 15%: 1-Marcador de peso molecular; 2- Planta sadia; 3- Extrato de plantas infectadas com o vetor 5 do Vírus do Mosaico do Caupí (CPMV); 4 Extrato de planta infectada com CAEV 1/6; 5- Proteína p28 do Vírus da artrite e encefalite caprina (CAEV) comercial 6- proteína p28 do CAEV produzia em plantas purificada e precipitada com TCA; 7- CPMV precipitado com TCA; 8- CAEV purificado e precipitado com PEG.

ío    Figura 7 referente ao Western blotting, mostrando que anticorpos

policlonais de caprinos infectados com o Virus da artrite e encefalite caprina (CAEV), reconheceram especificamente a proteína heteróloga p28 produzida em plantas V. unguiculata e o vírus CAEV: 1-Extrato de planta de V. unguiculata não infectada; 2-Extrato de plantas de V. unguiculata infectada com 15 o plasmideo pBinP-NS1 RNA-2 contendo o inserto da p28; 3 e 4- Vírus da artrite e encefalite caprina (CAEV) multiplicado em culturas de células

A Figura 8 demonstra o teste de “Dot Blot com anticorpos policlonais de caprinos infectados com o CAEV, evidenciando reações específicas entre a p28 produzida em plantas V. unguiculata e o CAEV: A-Extrato de planta de V. 20 unguiculata infectada com o plasmídeo pBinP-NS1 RNA-2 contendo o inserto da p28; B- Vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) multiplicado em culturas de células e C-Extrato de planta de V. unguiculata não infectada

A Figura 9 demonstra a imunogenicidade da Proteína p28 produzida em plantas revelando um teste de ELISA (Enzyme linked immunossorbent assay) 25 com anticorpos policlonal de caprinos infectados com o CAEV, na diluição de 1:100. As placas foram sensibilizadas com 0,2 pg de proteína em cada poço. Os resultados mostram reações específicas contra a p28 (comercial), vírus CAEV de sobrenadante de cultura de células, Extrato bruto de V. unguiculata infectadas com o vetor contento o inserto da proteína p28, proteína p28 30 purificada de extrato de planta infetada pelo vírus CAEV. Os dados são

estatisticamente diferentes quando comparados com a absorbância do extrato de planta sadia (controle negativo).

Descrição Detalhada da Invenção

5    Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de revelar algumas

das inúmeras maneiras de se realizar a invenção sem limitar, contudo, o seu escopo.

Processo de Produção de Proteína p28

O Processo de produção de material biológico heterólogo relacionado à 10 proteína p28 da presente invenção compreende Vírus da Artrite e Encefalite Caprina em sistema vegetal.

Em uma realização preferencial, o material biológico contem o inserto viral ser cDNA da Artrite e Encefalite Caprina.

Em uma realização preferencial, a planta é Vigna unguiculata.

15    O Processo de produção de material biológico heterólogo relacionado à

proteína p28 da presente invenção compreende as etapas de:

a)    inserção do material biológico do vírus da Artrite e Encefalite Caprina no genoma do vírus de planta;

b)    inoculação do material biológico do vírus de planta, o qual contém

20    o inserto viral, em plantas.

Em uma realização preferencial, o genoma do vírus de planta é o CPMV, o material biológico do vírus da Artrite e Encefalite Caprina é DNA e o material biológico contendo o inserto viral é cDNA.

Em uma realização preferencial, a planta é Vigna unguiculata.

25    Em uma realização preferencial, o processo de produção adicionalmente

compreende a etapa de obter o material biológico heterólogo relacionado à proteína p28 diretamente das folhas da planta.

Em uma realização preferencial, o Processo compreende as etapas de:

a)    inserção das sequências de DNA do vírus da Artrite e Encefalite

30    Caprina no genoma do vírus de planta (CPMV);

b)    inoculação do cDNA do CPMV contendo o inserto viral em plantas

de Vigna unguiculata; e

c) obíenção da proteína p28 diretamente das folhas da referida planta.

Uso da Proteína p28 para produção de imunóqeno

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Uso de pelo menos parte da sequência relacionada à proteína p28 do vírus da Artrite e Encefalite Caprina caracterizado por ser para inoculação de sistema vegetal para produção de imunógeno contra CAEV.

Em uma realização preferencial, a referida inoculação é mediada por um vírus não natural contendo a referida sequência codificante.

Em uma realização preferencial, o referido imunógeno é produzido nas folhas de plantas.

O processo de produção de proteína P28 da presente invenção também pode compreender, em uma realização opcional, as etapas de:

a)    Desenho dos oligonucieotídeos (primers)

b)    inserção das sequências de DNA do CAEV no genoma do vírus de planta (CPMV);

c)    inoculação do cDNA do CPMV contendo o inserto viral da p28 do CAEV em plantas de Vigna unguiculata;

d)    obtenção da proteína p28 diretamente das folhas das referidas plantas. Em uma realização preferencial, o processo compreende a etapa

adicional de purificação das proteínas obtidas.