Extrato hidroalcoólico e butanólico de sapindus saponaria com atividade espermicida e trichmonicida

  • Número do pedido da patente:
  • PI 1106670-9 A2
  • Data do depósito:
  • 13/10/2011
  • Data da publicação:
  • 13/08/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 33/02
    Agentes antiparas?ticos; / Antiprotozo?rios, p. ex. para leishmaniose, tricomoniase, toxoplasmose;
    ;
    A61P 15/02
    F?rmacos para o tratamento de doen?as genitais ou sexuais; Anticoncepcionais; / para doen?as da vagina;
    ;
    A61K 36/77
    Prepara??es medicinais contendo materiais de constitui??o indeterminadas derivados de algas, l?quens, fungos ou plantas, ou derivados dos mesmos, p. ex. medicamentos tradicionais ? base de ervas; / Magnoliophyta (angiospermas); / Magnoliopsida (dicotiled?neas); / Sapindaceae (fam?lia do "Spindus"), p. ex. lichia ou sapon?ria;
    ;
    A61P 15/16
    F?rmacos para o tratamento de doen?as genitais ou sexuais; Anticoncepcionais; / Anticoncepcionais masculinos;
    ;

EXTRATO HIDROALCOÓLICO E BUTANÓLICO DE SAPINDUS SAPONARIA COM ATIVIDADE ESPERMICIDA E TRICHOMONICIDA. A presente invenção trata-se da atividade espermicida e trichomonicida de dois extratos de sapindus saponaria bem como de seus princípios ativos com efetiva aplicação como espermicida e trichomonicida. A invenção constitui-se nos extratos hidroalcoólicos e butanólico da planta sapindus saponaria, cujos princípios ativos são eficientes para levar à morte dos espermatozóides humanos e também como microbicida, mais especificamente como anti-parasitário contra trichomonas vaginalis, que é o agente causal da doença sexualmente transmissível (DST). Ambos os extratos testados frente a espermatozóides humanos obtidos de doadores saudáveis bem como a cepas de trichomona vaginalis (cepa padrão e cepa clínica isolada de paciente com trichomoníase) levaram ´morte de todos os espematozóides que estavam vivos e viáveis em condições normais do doador no momento da coleta bem como a morte dos todos trichomonas submetidos aos extratos.

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Documento

EXTRATO HIDROALCOÓLICO E BUTANÓLICO DE Sapindus saponaria COM ATIVIDADE ESPERMICIDA E TRICHOMONICIDA

Introdução

A presente invenção trata-se da atividade espermicida e trichomonicida de dois 5 extratos de Sapindus saponaria bem como de seus princípios ativos com efetiva aplicação como espermicida e trichomonicida. A invenção constitui-se no extrato hidroalcoólico e no extrato butanólico da planta Sapindus saponaria, cujos princípios ativos são eficientes para levar á morte dos espermatozóides humanos e também como microbicida, mais especificamente como anti-parasitário contra Trichomonas vaginalis, que é o agente causai 10 mundialmente mais freqüente de doença sexualmente transmissível (DST). Ambos os extratos testados frente á espermatozóides humanos obtidos de doadores saudáveis bem como á cepas de Trichomonas vagincdis (cepa ATCC e cepa clínica isolada de paciente com trichomoníase) levaram á morte de todos os espermatozóides que estavam vivos e viáveis em condições normais do doador no momento da coleta bem como á morte dos todos 15 trichomonas submetidos aos extratos.

Considerando as atividades apresentadas pelos extratos hidroalcoólico e butanólico da planta Sapindus saponaria, os mesmos despontam como importantes opções para o desenvolvimento de formas farmacêuticas tópicas (de utilização via vaginal) que apresentem atividade espermicida e, portanto, funcionem como contraceptivo, e 20 concomitantemente trichomonicida. Estes extratos podem ainda ser incorporados á contraceptivos de barreira, como os preservativos masculino e feminino (camisinha), diafragma, escudo, capuz cervical e esponja contraceptiva, no sentido de ampliar a segurança contraceptiva dos mesmos bem como sua ação contra DSTs.

Estado da Técnica

25    A invenção constitui-se nos extratos hidroalcoólico e butanólico da planta Sapindus

saponaria, cujos princípios ativos são eficientes para levar á morte dos espermatozóides humanos e também como microbicida, mais especificamente como anti-parasitário contra Trichomonas vaginalis. Compostos naturais com atividade espermicida e/ou trichomonicida não são disponibibilizados no Brasil, sendo que a presente invenção possui estas duas 30 funções. Sapindus saponaria é uma planta amplamente encontrada no Brasil, pode levar ao interesse na produção de formas farmacêuticas de uso tópico (vaginal) que em muito pode beneficiar a população por seu baixo custo e elevada eficiência.

Na busca de anterioridade foi encontrado apenas artigos que citam o uso do Sapindus mukurossi com atividade espermicida, que é originário da índia,.porém a referida planta é uma outra espécie do gênero Sapindus, diferentemente da presente invenção que se trata o extrato da Sapindous saponária.

5    Na busca de anterioridade foi encontrada a patente US 5196197, que se refere à

atividade espermicida de uma planta denominada óleo de neem e seus derivados. Esta planta é do grupo Sapindus da índia, diferindo, portanto da Sapindus saponaria brasileira, a qual está sendo solicitando a patente.

Após a busca de anterioridade não foi encontrada nenhuma patente que se refira à 10 atividade espermicida ou trichomonicida de Sapindus saponaria.

O Nonoxinol-9 (N-9) é uma substância sintética amplamente utilizada mundialmente como um espermicida, sendo um detergente não-iônico. No entanto, estudos têm mostrado que o uso freqüente de N-9 pode causar irritação vaginal e ulcerações, que pode realmente aumentar o risco de transmissão HIV-1 e outras DSTs. Além disso, o N-9 apresenta total 15 incapacidade como um microbicida, não atuando sobre DSTs. Os extratos de Sapindus saponaria são compostos naturais, de uma planta brasileira, apresentam atividade espermicida em baixas concentrações e não apresentam toxicidade celular, além de serem trichomonicidas e antifúngicos (este último já comprovado em artigos na literatura científica e com patente em andamento), portanto, atuando também em algumas DSTs quando usado 20 como tópico (via vaginal) ou incorporados a contraceptivos de barreira. Além disto, possuem a vantagem de baixo custo de produção, uma vez que a atividade espermicida já foi obtida com os extratos da planta, sem a necessidade de isolamento de composto ativo para que a atividade fosse obtida.

O tratamento clássico para tricomoníase envolve drogas da família dos 25 nitroimidazólicos, entre os quais metronidazol e tinidazol são as únicas drogas com eficácia comprovada. O metronidazol tem sido a droga de escolha para infecção por Trichomonas vaginalis. No entanto, tem havido um aumento de resistência do Trichomonas vaginalis ao metronidazol. Além disso, os efeitos coláterais mais comuns do tratamento com metronidazol são náuseas e tontura, que foram relatados em até 12% dos patients., além do 30 desenvolvimento de reações de hipersensibilidade, geralmente manifestando-se como sintomas dermatológicos.

Como vantagens, como citado acima, os extratos de Sapindus saponaria são

compostos naturais, de uma planta brasileira, apresentam atividade trichomonicidas em baixas concentrações e não apresentam toxicidade celular, além de serem espermicida e antifúngico (este último já comprovado em artigos na literatura científica e com patente em andamento), portanto, atuando também em algumas DSTs quando usado como tópico (via 5 vaginal) ou incorporado a contraceptivos de barreira. Além disto, possuem a vantagem de baixo custo de produção, uma vez que a atividade espermicida já foi obtida com os extratos da planta, sem a necessidade de isolamento de composto ativo para que a atividade fosse obtida.

Descrição Detalhada do Invento 10    1. Atividade espermicida

Foram utilizadas amostras de sêmen humano recém-coletadas por masturbação para a realização dos ensaios de atividade espermicida de extratos de Sapindus saponaria(L). O sêmen foi coletado de homens saudáveis, jovens e férteis em frasco estéril, que foram colocados em estufa a 37 °C/30 minutos para a sua liquefação. O sêmen liquefeito foi 15 utilizado para os testes. As características físicas do sêmen relativas á viscosidade, volume, pH e morfologia foram determinados conforme preconiza a Organização Mundial da Saúde. Apenas as amostras com contagem de espermatozóides >60X106/ml, motilidade >65%, e morfologia e características físicas normais foram utilizados no estudo.

Determinação da concentração efetiva mímima (MEC) dos extratos de Sapindus 20 saponaria

Para avaliar a atividade espermicida e determinar da Concentração Efetiva Mínima (MEC) dos extratos hidroalcoólico e butonólico de Sapindus saponaria, foram utilizados ambos os extratos na concentração de 10 mg/ml, que encontravam-se liofilizados e congelados, que foram dissolvidos em água destilada estéril momentos antes da realização 25 dos experimentos.

Os extratos hidroalcoólico e butanólico foram individualmente diluídos em tubos de hemólise na razão de 1:2 até 1:32 com salina, sendo que o tubo 1 correspondia ao extrato com 10 mg/ml, o tubo 2, 5mg/ml e assim sucessivamente. O volume final de cada um destes tubos era de 0,5 ml. Volumes de 0,1 ml de sêmen liquefeito foi adicionado ao tubo 1, que 30 foi vortexado por 10 segundos. Imediatamente após este tempo, 10 pl do conteúdo do tubo 1 foi colocado entre lâmina e lamínula e observado á microscopia óptica comum, objetiva de 40X. Foi então determinada á percentagem de espermatozóides imóveis (possivelmente

mortos) num total de num total de 5 campos microscópicos analisados (tempo total de 20 segundos). O mesmo foi realizado para os tubos subseqüentes com as diluições dos extratos. A MEC foi determinada em três amostras de sêmen de diferentes doadores e foi considerada como a maior diluição do extrato capaz de imobilizar todos os espermatozóides em 20 segundos. Foi também utilizado um tubo como controle positivo da ação espermicida, que continha 0,1 ml de sêmen liquefeito e 0,4 ml de gel vaginal contendo nonoxynol-9 (Preserv, Blausiegel, 20 mg/g), lg dissolvido em 0,5 ml de salina. Este é o espermicida comercial padrão. Como controle negativo da atividade espermicida, foi utilizado um tubo contendo 0,1 ml de sêmen liquefeito e 0,4 ml de salina. O experiemento nestes tubos controle foi executado de maneira idêntica aos tubos testes.

Logo após a vortexação do sêmen em contato com o extrato, foi também realizado a coloração dos espermatozóides com corantes supra-vitais para confirmação da percentagem de espermatozóides mortos. Um total de 10 pil do conteúdo do tubo 1 foi adicionado em novo tubo de hemólise contendo 1 gota de eosina amarela e 2 gotas de nigrosina (corantes supra-vitais), que foram imediatamente homogeneizados, dispensados em lâmina microscópica na forma de esfregaços por extensão, que foi seco imediatamente por calor seco. A leitura foi realizada em microscópioc óptico comum, objetiva de 40X. A eosina amarela cora de vermelho os espermatozóides mortos. Os vivos não são corados e são observados na cor branca deviso ao contraste com a nigrosina, que cora o fundo do esfregaço de escuro. Foi determinada a percentagem de espermatozóides mortos num total de 200 espermatozóides contados. O mesmo procedimento foi realizado com os tubos subseqüentes e com os controles, após vortexação.

Como resultados, tanto para o extrato hidroalcoólico quanto para o butanólico a 2,5 mg/ml de extrato, 100,0% dos espermatozóides estavam imóveis e esta foi a concentração determinada como MEC, expressa em gram%, ou seja, MEC=2,5 (gram%). Todos os espermatozóide (100%) estavam imóveis com do nonoxynol-9 (controle positivo da atividade espermicida) e a percentagem de espermatozóide imóveis no controle negativo da ação espermicida (sêmen com salina) foi de 35%.

Para os dois extratos nestes valores de MEC acima citados, com a técnica da eosina nigrosina, 100% dos espermatozóides estavam mortos. Para o nonoxynol-9, também 100% dos espermatozóide estavam mortos (controle positivo) e para o controle negativo, 30% mortos.

Determinação da concentração sub-óptima (EC50)

Para determinar a EC50, 0 tubo 3 para ambos os extratos que foi determinado como MEC foi diluído em uma série de tubos na razão de 1:5 com salina, de maneira que no tubo 1 a concentração de extrato foi de 2,5 mg, no tubo 2 0,5 mg, e assim sucessivamente até o 5 tubo 5. O volume final de cada um destes tubos era de 0,5 ml. O procedimento foi igual para a determinação da MEC, ou seja, volumes de 0,1 ml de sêmen liquefeito foi adicionado ao tubo 1, que foi vortexado por 10 segundos. Imediatamente após este tempo, 10 pl do conteúdo do tubo 1 foi colocado entre lâmina e lamínula e observado á microscopia óptica comum, objetiva de 40X. Foi então determinada á percentagem de espermatozóides imóveis 10 num total de 5 campos microscópicos analisados (tempo total de 20 segundos). O mesmo foi realizado para os tubos subseqüentes com as diluições dos extratos. A EC50 foi determinada em três amostras de sêmen de diferentes doadores e foi considerada como a maior diluição do extrato capaz de imobilizar 50% dos espermatozóides em 20 segundos.

Logo após a vortexação do sêmen em contato com o extrato, foi também realizado a 15 coloração dos espermatozóides com corantes supra-vi tais para confirmação da percentagem de espermatozóides mortos. Um total de 10 pl do conteúdo do tubo 1 foi adicionado em novo tubo de hemólise contendo 1 gota de eosina amarela e 2 gotas de nigrosina (corantes supra-vitais), que foram imediatamente homogeneizados, dispensados em lâmina microscópica na forma de esfregaços por extensão, que foi seco imediatamente por calor 20 seco. A leitura foi realizada em microscópioc óptico comum, objetiva de 40X. A eosina amarela cora de vermelho os espermatozóides mortos. Os vivos não são corados e são observados na cor branca deviso ao contraste com a nigrosina, que cora o fundo do esfregaço de escuro. Foi determinada a percentagem de espermatozóides mortos num total de 200 espermatozóides contados. O mesmo procedimento foi realizado com os tubos 25 subseqüentes, após vortexação.

Como resultados, para o extrato hidroalcoólico a 0,5 mg/ml, 50,0% dos espermatozóides estavam imóveis e esta foi á concentração considerada como EC50, expressa em gram%, ou seja, EC5o=0,5 (gram %). Para o extrato butanólico a 0,1 mg/ml de extrat), 50,0% dos espermatozóides estavam imóveis e esta foi á concentração considerada 30 como EC50, ou seja, EC5o=0,l (gram %) (Tabela 1).

O teste com eosina-nigrosina confirmou que 50% dos espermatozóides estavam mortos com EC5o=0,5 (gram %) para o extrato hidroalcoólico e EC50=0,1 (gram %) para o

extrato butanólico.

Teste hipo-osmótico (SWELLING TEST)- Determinação da ação dos extratos sobre a membrama dos espermatozóides

O efeito dos extratos sobre a permeabilidade da membrana plasmática dos espermatozóides foi avaliado através do teste hipo-osmótico (HOST), que determina mais especificamente a integridade fisiológica da membrana dos espermatozóides.

Alíquotas de 0,1 ml de sêmen liquefeito foi adicionado a tubos contendo 0,5 ml do extrato espermicida na concentração do valor do MEC obtido acima (1 tubo para cada um dos dois extratos em sua concentração de MEC) e incubados por 1 min/ 37 °C.

10    Os espermatozóides foram então peletizadas por centrifugação (800g/5min) e 0,5ml

de solução hipo-osmótica (75 mM de frutose, 25 mM de citrato de sódio) foi adicionada. A mistura incubada por 30 min/37 °C e após, 10 pi foi colocado sobre lâmina e lamínula e observado ao microscópio óptico comum, objetivas de 10X, 20X e 40X, e os espermatozóides com e sem ondulação da cauda e/ou sem inchaço foram contados num total 15 de 200 espermatozóides e os resultados expressos em percentagem. Foram realizados experimentos em duas diferentes amostras de sêmen. Os espermatozóides sem cauda enrolada e/ou sem inchaço correspondem aos mortos, cujos extratos tiveram atividade sobre a permeabilidade da membrana plasmática, alterando-a e acarretando na morte dos mesmos. Foi também utilizado 1 tubo como controle positivo da ação espermicida, que continha 0,1 20 ml de sêmen liquefeito e 0,4 ml de creme vaginal contendo nonoxynol-9 (lg dissolvido em 0,5 ml de salina). Como controle negativo da atividade espermicida, foi utilizado um tubo contendo 0,1 ml de sêmen liquefeito e 0,5 ml de salina.

Como resultados, tanto para o extrato hidroalcoólico quanto para o butanólico (MEC= 2,5 gram%), foram observados 100,0% de espermatozóides mortos, ou seja, 100% 25 sem cauda enrolada e/ou sem inchaço. No tubo do nonoxynol-9 (controle positivo da atividade espermicida), houve uma taxa de 0,02% de espermatozóides vivos (cauda enrolada e/ou sem inchaço) e no tubo controle negativo da ação espermicida (sêmen com salina), houve 60% de espermatozóides vivos (cauda enrolada e/ou inchados) (Tabela 2).

2. Teste de susceptibilidade de Trichomonas vaginalis aos extratos hidroalcoólico e 30 butonólico de Sapindus saponaria - atividade trichomonicida

Para avaliar a atividade trichomonicida e determinar da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos extratos hidroalcoólico e butonólico de Sapindus saponaria contra

Trichomonas vaginalis, foram utilizados ambos os extratos na concentração de lOmg/ml, que encontravam-se liofilizados e congelados, e foram dissolvidos em água destilada estéril momentos antes da realização dos experimentos. Quanto aos parasitas, foram utilizadas culturas de uma cepa ATCC e de uma cepa clínica (isolada de uma paciente com 5 trichomoníase), denominada CAR. Estas cepas foram cultivadas por 48h em tubos contendo meio TYM- Trypticase-Yeast extract-Maltose, apropriado para o crescimento dos parasitas. Após o crescimento, os tubos foram centrifugados para a separação dos protozoários do meio de cultura. A seguir, foi preparada uma suspensão do parasita contendo 1,0x105 a 5,0x103 parasitas/ml, em água destilada estéril, determinada em Câmara de Neubauer.