Oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras

  • Número do pedido da patente:
  • PI 1106599-0 A2
  • Data do depósito:
  • 26/09/2011
  • Data da publicação:
  • 01/09/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 15/11
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas;
    ;
    C12Q 1/04
    Processos de medi??o ou ensaio envolvendo enzimas ou micro-organismos; Composições para esse fim; Processos de preparação de tais composições; / envolvendo micro-organismos vi?veis; / Determinando a presen?a ou tipo de micro-organismo; Uso de meios seletivos para ensaiar antibi?ticos ou bactericidas; Composições contendo indicador qu?mico para este fim;
    ;
    C12Q 1/68
    Processos de medi??o ou ensaio envolvendo enzimas ou micro-organismos; Composições para esse fim; Processos de preparação de tais composições; / envolvendo ?cidos nucleicos;
    ;

OLIGONUCLEOTÍDEOS, USO, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE CONTAMINAÇÃO DE AMOSTRAS POR LEVEDURAS. A presente invenção descreve oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A invenção está relacionada com a identificação taxonômica e detecção de leveduras em bebidas.

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Documento

OLIGONUCLEOTÍDEOS, USO, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE CONTAMINAÇÃO DE AMOSTRAS POR LEVEDURAS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve oligonucleotídeos universais, uso, método e kit 5 para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A presente invenção se situa no campo industrial.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O processo de detecção de leveduras é efetuado por plaqueamento em meios próprios e por meio de técnicas de biologia molecular. Entre estas últimas, a PCR e suas 10 variações têm sido amplamente empregadas. O par de oligonucleotídeos da presente invenção foi desenhado para detectar qualquer gênero de levedura e ser empregado como controle positivo de amplificação em PCR. Desta forma, os oligos da presente invenção auxiliam na verificação da eficácia de diferentes processos de extração de DNA, em produtos alimentícios e em bebidas, especialmente vinho, cerveja e cidra.

15    Existem muitos oligos para detectar leveduras específicas como os descritos em

WO 2007132589 (grupo de primers utilizados para detectar D.anômala, D.bruxellensis, D.custersiana ou B.naardenensis), WO 2008/006985 (kit para detecção de contaminação por leveduras Brettanomyces), US 2004/0166492 (novos oligonucleotídeos capazes de se ligar à região do espaçador transcrito interno de 20 Dekkera bruxellensis, entre outros, sendo útil para a identificação de microorganismos relacionados à fermentação), FR 2908786 (kit para detecção de contaminação de leveduras Brettanomyces), WO 2007/021027 (oligonucleotídeos, arranjos contendo esses oligos, aparato, método e kit de detecção de microorganismos, incluindo Dekkera), US 20080268430 (métodos e kits relacionados a detecção, identificação e 25 quantificação de leveduras em vinho, cerveja e sucos). No entanto, poucos documentos mostram oligos universais para identificação de leveduras sem a detecção de outros microorganismos.

Andorrà et al. (Andorrà, i.; Landi, s.; Mas, a; Guillamón, j.m.; Esteve-zarzoso, b. Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food microbiol, 25(7): 849—856, 2008) utilizaram PCR em processos de avaliação de populações de leveduras, bactérias lácticas e acéticas em vinho para evitar o emprego de técnicas dependentes de meios de cultura. A PCR aliada a outras técnicas tem sido empregada para caracterizar leveduras, presentes em presunto (Andrade, m.j.; Rodríguez, m.; Casado, e.; Córdoba, j.j. Efficiency of mitochondrial dna restriction analysis and rapd-pcr to characterize yeasts growing on dry-cured iberian ham at the different geographic areas of ripening. Meat Science, 84(3): 377 - 383, 2010), entereococos de queijos (Andrighetto, c.; Psomas, e.; Tzanetakis, n.; Suzzi, g.; Lombardi. A randomly amplified polymorphic DNA (rapd) PCR for the identification of yeasts isolated from dairy products. Lett appl microbiol 30(1): 5—9, 2000; Andrighetto, c.; Knijff, e.; Lombardi, a; Torriani, s.; Vancanneyt, m.; Kersters, k.; Swings, j.; Dellaglio, f. Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from italian cheeses. j dairy res, (68)(2): 303—316, 2001) e lactobacilos em produtos cárneos (Andrighetto, c.; Zampese, L; Lombardi. A rapd-pcr characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of veneto region (italy)., lett appl microbiol, 33(1): 26—30, 2001a) . A diversidade microbiana de queijos também foi determinada por técnicas associadas a PCR (andrighetto, et al. 2004). lactobacilos termofílicos foram identificados por amplificação por PCR, utilizando primers espécie-específicos para amplificar segmento da região do gene 16s rRNA (andrighetto et al., 1998).

Há processos que envolvem PCR na identificação de leveduras (De barros lopes, m.; Soden, a.; Henschke, p.a.; Langridge, p. PCR differentiation of commercial yeast strains using intron splice site primers. appl environ microbiol, 62: 4514—4520, 1996; De barros lopes. m.; Soden, a.; Martens; a.l; Henschke, p.a.; Langridge, p. Differentiation and species identification of yeasts using per. int j syst bacteriol, 48: 279—286, 1998; Arroyo-lópez, f.n.; Durán-quintana, m.c.; Ruiz-barba, j.l.; Querol, a.; Garrido- femández, a. Use of molecular methods for the identification of yeast associated with table olives, food microbiology, 23: 791 - 796, 2006; Borman, a.m.; Linton, c.j; Miles, s.j; Campbell, c.k.; Johnson, e.m. Ultra-rapid preparation of total genomic DNA from isolates of yeast and mould using whatman fta filter paper technology - a reusable dna archiving system. med mycol, 44: 389—398, 2006. Cada um destes trabalhos apresentam procedimentos e possuem detalhes específicos que abrangem desde os primers propriamente ditos, como regiões diferentes do DNA, às condições de técnicas de amplificação. Algums primers são específicos para um determinado gênero ou espécie de leveduras operando com uma variação da técnica denominada PCR aninhada (Ibeas, j.i.; Lozano, i.; Perdigones, f.; Jimenez, j. Detection of dekkera-brettanomyces strains in sherry by a nested {per} method. appl environ microbiol, 62: 998—1003, 1996), outros usam primers derivados de 28 RNA (WO 2007/062442) para a detecção de leveduras e fungos filamentosos (WO 2007/062442) e, finalmente, outros ainda são mais gerais pois detectam bactérias, fungos filamentosos e leveduras com primers e sondas derivados de 16s rRNA e de 18s rDNA (US 2004/0265850) e micro-organismos (WO 2004/009839). Todos estes métodos diferem da presente invenção e se caracterizam por apresentar, além de tudo, procedimentos complexos.

Quando se pretente amplificar um segmento de DNA, o primer desenhado para tal fim é empregado de imediato. Fatores externos podem interferir de tal sorte que a amplificação não se realiza. Surgem dúvidas sobre o primer, as condições de amplificação e as atividades das polimerases (Taq e Thh). A presente tecnologia permite a amplificação de um segmento de aproximadamente 375 pb da região 18S do DNA ribossômico de leveduras. Este par de oligonucleotídeos possui capacidade de amplificar pequenas quantidades de DNA. Por se tratar de um primer que pode ser utilizado para qualquer gênero de levedura, a escolha de um gênero de fácil acesso e de crescimento rápido para testes da eficiência das polimerases torna o processo de otimização da amplificação por PCR com outros primers, mais dinâmico. Assim, a inibição por diferentes compostos da amplificação por PCR e a eficiência de diferentes procedimentos de extração de DNA podem ser facilmente avaliadas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma 5 que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção descreve oligonucleotídeos, seu uso para detecção de leveduras, método e kit compreendendo tais oligonucleotídeos, para serem 10 utilizados para detecção da contaminação por leveduras.

De acordo com a primeira concretização da invenção é provido um grupo de oligonucleotídeos para uso na detecção de leveduras, caracterizado por hibridizar especificamente com as seqüências selecionadas do grupo de SEQ ID NOl ou SEQ ID N02.

15    Uma segunda concretização da invenção diz respeito ao uso ao uso de marcador

molecular específico selecionado do grupo descrito em SEQ ID NOl ou SEQ ID N02.

Uma terceira concretização da presente invenção diz respeito a um método de detecção de contaminação por leveduras compreendendo as etapas de:

a.    realizar a reação de amplificação, de ácido nucléico contido em uma

20    amostra através da utilização de oligonucleotídeos que hibridizam

especificamente com a região 18S DNAr de microorganismos; e

b.    detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença do microorganismo.

25    Uma quarta concretização da presente invenção diz respeito a um kit de

identificação de microorganismos em uma amostra caracterizado por compreender aparato para realização da reação de amplificação e reagentes de amplificação compreendendo os oligonucleotídeos da presente invenção.

Uma quinta concretização da invenção diz respeito ao uso dos oligonucleotídeos da presente invenção caracterizado por ser na identificação de microorganismos em amostras.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos 5 versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Amplificação de um específico de DNA de 375 bp da região 18S de Dekkera e Saccharomyces: M- 100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae - padrão com células 10 lisadas com tampão de lise; 2- D. bruxellensis -padrão com células lisadas com tampão de lise; 3- Sacch. cerevisiae - células lisadas com fervura; 4- D. bruxellensis - células lisadas com fervura; 5 - Sacch. cerevisiae - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; 6- D. bruxellensis - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; A- 25 ciclos; B- 30 ciclos; C- 35 ciclos.

15    DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As leveduras estão presentes em vários tipos de bebidas, como bebidas alcoólicas e refrigerantes. Assim, a presença ou ausência de levedura pode ser utilizada como um indicador do controle de qualidade de vários tipos de bebidas. Assim, o grupo de oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção é útil para o controle de 20 qualidade de vários tipos de bebidas (por exemplo, bebidas alcoólicas e refrigerantes, e, particularmente, vinho e cerveja) e do exame de amostras ambientais.

A presente invenção está relacionada particularmente ao desenvolvimento de um grupo de oligonucleotídeos para identificação taxonômica de leveduras. A presente invenção também está relacionada com o uso no método de identificação de leveduras 25 em bebidas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente também para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte

inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras.

A presente invenção compreende o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer a região 18S rDNA de leveduras.

A presente invenção também está relacionada com uma metodologia para identificação taxonômica de leveduras por meio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase utilizando um par de oligonucleotídeos específico baseado na região 18S do DNA ribossômico. A inovação consiste no desenvolvimento de oligonucleotídeos baseados em uma região do DNA ribossômico ainda não utilizada para a detecção de leveduras de uma forma geral, tendo como consequência o desenvolvimento de um método de detecção confiável e viável de ser utilizado na rotina industrial.

A vantagem é que permite, com alto grau de confiabilidade, a detecção de várias espécies de leveduras que são contaminantes de bebidas, entre elas o vinho, e que causam perdas econômicas ao setor vinícola ao se desenvolverem no produto final e produzirem quantidade de compostos fenólicos acima do limiar de percepção (LP). Permite a detecção rápida da contaminação por leveduras, possibilitando ações que reduzam as perdas econômicas.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

“Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’-3’ da seqüência de interesse.

“Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ da seqüência de interesse.

O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”.

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.

O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido 5 nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos 10 nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita 15 refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico 20 alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador 25 de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para 30 produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em