Método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, uso de uma quantidade eficaz de uma lectina ligante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, lectina ligante de beta-galactosíodeo ou derivados e produto

  • Número do pedido da patente:
  • PI 1005702-1 A2
  • Data do depósito:
  • 21/12/2010
  • Data da publicação:
  • 02/04/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • A61K 38/22
    Prepara??es medicinais contendo pept?deos; / Pept?deos tendo mais de 20 amino?cidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Seus derivados; / de animais; de humanos; / Horm?nios;
    ;
    A61P 15/08
    F?rmacos para o tratamento de doen?as genitais ou sexuais; Anticoncepcionais; / para dist?rbios gonadais ou para aumentar a fertilidade, p. ex. indutores de ovula??o ou de espermatog?nese;
    ;
    A61P 5/34
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios do sistema end?crino; / dos horm?nios sexuais; / Gest?genos;
    ;

MÉTODO PARA AUMENTAR A TAXA DE IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES NO ÚTERO MATERNO EM MAMÍFEROS, USO DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UMA LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS DA MESMA, LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS E PRODUTO. A presente invenção refere-se a um método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, por meio do fornecimento ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma lectina ligante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, bem como a um produto compreendendo dita lectina.

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Documento

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA AUMENTAR A TAXA DE IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES NO ÚTERO MATERNO EM MAMÍFEROS, USO DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UMA LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVA-5 DOS DA MESMA, LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS E PRODUTO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, por meio 10 do fornecimento ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma lectina ligante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, bem como a um produto compreendendo dita lectina.

Descrição do estado da técnica

A agropecuária brasileira desempenha um papel importante no 15 cenário econômico nacional, dada a sua representatividade atual no Produto Interno Bruto e contribuição positiva para a balança comercial brasileira.

Para ser rentável no mercado agropecuário, qualquer propriedade precisa manter a eficiência reprodutiva dos animais criados a fim de a-tender as exigências dos consumidores por produtos de alta qualidade. Nes-20 se sentido, a manutenção de índices satisfatórios de nascimentos é o ponto fundamental da cadeia de eventos que resulta no lucro de uma propriedade agropecuária. Manter a reprodução em níveis ideais, todavia, é um processo quase sempre complicado devido às taxas de perdas embrionárias no início da gestação.

25    A reprodução pode ser definida como a concepção de seres da

mesma espécie após uma sequência de eventos fisiológicos que, por sua vez, dependem de uma multiplicidade de fatores. A aplicação de biotécnicas de reprodução avançadas no setor agropecuário pode auxiliar no melhoramento genético animal e, consequentemente, aumentar o potencial de pre-30 nhez (implantação de embriões no útero materno), de forma a permitir que o animal obtenha o máximo de produtividade durante a sua vida útil.

Entretanto, no mundo todo, a perda embrionária é uma das causas mais comuns de prejuízo econômico para os pecuaristas, e prevenir a mortalidade embrionária precoce ainda é um desafio diante dos mecanismos complexos que envolvem o diagnóstico e a manutenção da gestação.

5    O diagnóstico precoce que identifica a taxa de implantação de

embriões no útero materno em mamíferos é uma ferramenta importante em procedimentos agropecuários, pois viabiliza a tomada de providências futuras e minimiza possíveis perdas econômicas. Nesse sentido, novas tecnologias têm sido aperfeiçoadas a partir de um melhor conhecimento da fisiolo-10 gia reprodutiva ovariana desses animais, visando a atingir melhores resultados reprodutivos e a redução no valor dos tratamentos.

A popularização das biotécnicas de reprodução assistida, a e-xemplo da fertilização de bovinos em laboratório, vem acontecendo de maneira gradual e tem sido motivada principalmente por necessidades merca-15 dológicas. O eficiente desempenho reprodutivo de um animal está diretamente ligado ao nascimento de um grande número de terneiros (crias de vacas) do sexo feminino em raças com aptidão leiteira e do sexo masculino em raças com aptidão para corte, possibilitando assim o retorno econômico para as propriedades rurais.

20    Outros fatores de mercado, como a forte pressão do consumidor

mundial por qualidade, escala e padronização dos produtos de origem animal, somados à própria competição por espaço entre a pecuária, a agricultura e a bioenergia contribuem para uma maior produtividade, provocando um crescimento acelerado das biotécnicas de reprodução.

25    Nessa lógica que envolve o mercado globalizado de produção e

consumo de produtos primários, a agropecuária brasileira tem nas técnicas de reprodução assistida um forte aliado para elevar a produtividade média dos rebanhos, vez que permitem aumentar substancialmente a quantidade de nascimentos de animais geneticamente superiores.

30    As principais técnicas de reprodução utilizadas nas propriedades

rurais envolvem a (i) monta natural ou reprodução natural, (ii) inseminação artificial, (iii) produção in vivo seguida da transferência de embriões e (iv) produção in vitro seguida da transferência de embriões. Independentemente da técnica empregada, o principal objetivo do método de reprodução é permitir o aproveitamento máximo da espécie reprodutora, propiciando resultados positivos.

5    O montante natural é uma técnica bastante utilizada pelo fato de

incorrer em menos despesas aos proprietários rurais, porém apresenta como limitação a dificuldade no controle de doenças sexualmente transmissíveis e menor velocidade no ganho genético dos rebanhos. Neste procedimento, os embriões gerados são compostos por 50% do material genético do pai (e, 10 portanto, diferente do material genético da mãe), podendo acarretar na formação de um número elevado de aloantígenos, o que pode implicar em perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal.

Aloantígeno é qualquer molécula codificada pelo material genético proveniente de outro organismo de mesma espécie que, por ser diferente 15 e quando introduzido noutro organismo, induz o sistema imunológico deste a produzir uma série de respostas em defesa ao material "estranho". Como exemplo, cita-se o embrião recém-fecundado que contém metade do seu material genético de origem materna e a outra metade de origem paterna, sendo que esta última metade pode ser estranha ao sistema imune da mãe, 20 tornando-se, portanto, vulnerável à rejeição do organismo materno. A ausência da tolerância imunológica materno-fetal (processo pelo qual o organismo materno reconhece/aceita o feto sem que, para tanto, seja disparada uma resposta contra a sua permanência) é um dos principais motivos que conduzem ao aborto precoce.

25    Outra biotécnica de reprodução bastante utilizada no setor agro

pecuário é a técnica de inseminação artificial (IA) que, por sua vez, refere-se à deposição do sêmen (espermatozóide/gameta masculino e plasma seminal) no aparelho reprodutor feminino de forma artificial, com técnicas específicas desenvolvidas para adequação às particularidades anatômicas de cada 30 fêmea. O sucesso da IA é mensurado pela taxa de prenhez - ou número de fêmeas com gestação positiva em relação ao número de fêmeas insemina-das. Neste procedimento, os embriões gerados também são compostos por

50% do material genético do pai (e, portanto, diferente do material genético da mãe), podendo acarretar na formação de um número elevado de aloantí-genos, implicando, portanto, nos mesmos riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal.

5    Adicionalmente, a técnica de produção in vivo seguida da trans

ferência de embriões (TE) refere-se à biotécnica de reprodução na qual vários embriões são gerados no genital de uma fêmea doadora (aquela que doa o material genético) e transferidos ao útero de fêmeas receptoras da mesma espécie, as que serão responsáveis pela gestação chegar a termo. A 10 geração de embriões no útero das doadoras envolve técnicas de superovu-lação, inseminação artificial e colheita dos embriões. Após a colheita (flu-shing), os embriões serão avaliados e aqueles de boa viabilidade poderão ser inovulados ou criopreservados. A inovulação (deposição) dos embriões produzidos in vivo no útero ou corno uterino das receptoras depende dos 15 processos de sincronização de estro (adaptar o útero da receptora à mesma fase de desenvolvimento ou estágio embrionário). Neste procedimento, os embriões inovulados no organismo das receptoras são compostos por até 100% de aloantígenos (material genético diferente), pois são integralmente oriundos tanto do material genético das doadoras como do material genético 20 paterno, o que pode implicar em maiores riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal das receptoras.

Por outro lado, a técnica de produção in vitro seguida da transferência de embriões refere-se à geração de embriões em laboratório que serão transferidos ao útero de fêmeas receptoras da mesma espécie, as que 25 serão as responsáveis pela gestação chegar a termo. A geração dos embriões em laboratório depende (i) da aspiração de oócitos no ovário das doadoras através de punção folicular guiada por ultrassonografia; (ii) MIV - maturação oocitária in vitro seguida de indução in vitro dos mesmos eventos de maturação de citoplasma e núcleo oocitário, preparando o óvulo para a fecun-30 dação; (iii) FIV - fecundação in vitro ou processo de singamia dos oócitos maduros e espermatozóides capacitados; (iv) CIV - cultivo in vitro de embriões após a fecundação, até atingirem o estágio (mórula e/ou blastocisto)

necessário para a transferência ou inovulação depois de 5-7 dias de cultivo; (v) inovulação, quando após o período de cultivo, os embriões serão avaliados e os de boa viabilidade poderão ser inovulados, criopreservados e/ou vitrificados. A inovulação dos embriões produzidos in vitro no útero ou corno 5 uterino das receptoras também depende dos processos de sincronização de estro (adaptar o útero da receptora à mesma fase de desenvolvimento ou estágio embrionário). Neste procedimento, os embriões inovulados no organismo das receptoras são compostos por até 100% de aloantígenos (material genético diferente), pois são integralmente oriundos tanto do material ge-10 nético das doadoras como do material genético paterno, o que pode implicar em maiores riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal das receptoras.

Conforme descrito acima, a tolerância materno-fetal é um processo imunológico que regula a resposta preparada pelo organismo materno 15 contra o embrião ou feto. O sistema imunológico de um organismo é responsável por um conjunto complexo de reações a fatores externos e/ou agressores que possam perturbar seu estado fisiológico habitual.

As respostas imunorregulatórias durante o período de gestação são eventos decorrentes da ovulação, cópula e até da própria fecundação, 20 visando, sobretudo, o crescimento e o desenvolvimento do concepto (embrião ou feto e membranas associadas).

Nesse sentido, Lewis, S.K. et al, 2007 (em Galectin 15 [LGALS15]: A Gene Uniquely Expressed in the Uterí ofSheep and Goats that Functions in Trophoblast Attachment) observaram que, nos ruminantes, o 25 embrião em estágio de MO (mórula, entre dias 4-6) entra no útero e continua o seu desenvolvimento para o estágio BL (blastocisto, entre os dias 6-7), contendo então uma monocamada de células denominadas de trofectoder-ma. Após o rompimento da zona pelúcida até o dia D12 (12° dia) em ovelhas, ou D15 (15° dia) em cabras, os embriões permanecem na fase da e-30 longação. Durante essa fase o trofectoderma produz o interferon tau (IFNT) que, por sua vez, é responsável pela inibição da luteólise (regressão do corpo lúteo). Estando o corpo lúteo (folículo ovariano) ativo, a produção de pro-

gesterona (P4) é mantida e o endométrio (membrana mucosa que reveste a parede uterina) é preparado para uma possível gravidez. O estudo afirma ainda que a P4 e IFNT regulam a transcrição do gene da Galectina 15 no epitélio endometrial. A Galectina 15 teria a ação no ambiente uterino, pois 5 esta Galectina participa da fixação/adesão do trofectoderma do concepto ao endométrio do útero, estimulando assim respostas biológicas como a adesão e a migração, eventos críticos na fase de elongação do blastocisto e, consequentemente, na evolução da gestação.

Em um segundo momento, de acordo com o estudo de Farmer, 10 J.L. et aí, 2008 (em Galectin 15 (LGALS15) functions in trophectoderm mi-gration and attachment), a Galectina 15 estimularia a proliferação celular e a inibição de apoptose celular, ocorrências também importantes para a fase de implantação. Foi comprovado por estes autores que, muito embora o gene da Galectina 15 esteja presente nas espécies ovina, caprina e bovina, o 15 mRNA (RNA mensageiro) da Galectina 15 é expressado na fase de elongação somente de ovinos e caprinos, cuja expressão varia de acordo com fase do ciclo estral. Adicionalmente, verificou-se que a administração via uterina de IFNT exógeno aumentaria a expressão gênica da Galectina 15 somente se a fêmea recebesse um tratamento com P4, o que comprova a necessida-20 de conjunta da presença do IFNT e da P4 como indutores da transcrição do mRNA da Galectina 15.

Satterfield, M.C. et al, 2006 (em Progesterone Regulation ofPre-implantation Conceptus Growths and Galectin 15 [LGALS15] in the Ovine Uterus) concluíram que a P4 atua como indutor da expressão gênica de di-25 versas proteínas secretadas pelo endométrio, dentre elas a Galectina 15 e a Fosfoproteína 1 Secretada (SPP1), estas que são consideradas agentes reguladores da sobrevivência e do crescimento do concepto, bem como da adesão celular durante a fase de implantação. Nesse sentido, o estudo de Burghardt, R.C. et al, 2009 (em Enhanced focal adhesion assembly reflects 30 increased mechanosensation and mechanotransduction at maternal - conceptus interface and uteríne wall during ovine pregnancy) menciona que a SPP1 e a Galectina 15 são mecanossensores da interface entre concepto e

ambiente uterino.

Em outra linha de raciocínio, a pesquisa conduzida por Than, N.G. et al, 2008 (em Emergence of hormonal and redox regulation of galec-tin-1 in placental mammals: Implication in maternal-fetal immune tolerance) 5 concluiu que a Galectina 1 apresenta um alto grau de conservação estrutural, dimerização e propriedades de ligação com carboidratos e integrinas (proteínas de adesão), sugerindo que essas propriedades são conservadas entre os vertebrados e que mantêm um padrão de expressão gênicas entre os diferentes tipos de placenta (decíduas ou não). Os autores observaram 10 também que a Galectina 1 pode conferir imunotolerância maternal aos alo-antígenos fetais, regular a ação das células Natural Killer (NK) do útero e agir como agentes reguladores e moderadores das células T (células envolvidas na imunidade celular). Corroboram ainda com constatação da ação sinérgica da P4 na estimulação da produção de Galectina 1 pelo endométrio. 15    Diante de pesquisas focadas em estudos de fertilidade, é possí

vel verificar que a participação das Galectinas está associada à modulação de resposta imunológica e a eventos de elongação do embrião e de adesão dele ao endométrio.

As Galectinas são conhecidas como lectinas de mamíferos ligan-20 tes de beta-galactosídeos e podem ser expressas por uma grande variedade de tecidos. Essas lectinas são geralmente solúveis e não possuem peptídeo sinal, sendo secretadas por mecanismo independente do retículo endoplas-mático e do complexo de Golgi. Até o presente momento foram descritas 15 Galectinas derivadas de mamíferos, todas com domínio de reconhecimento 25 de carboidrato com aproximadamente 130 resíduos de aminoácidos.

É sabido que, no espaço extracelular, a interação das Galectinas com glicanas das superfícies de células do sistema imunológico pode promover a modulação da produção de citocinas e mediadores, adesão celular, apoptose, quimiotaxia e endocitose. Já no ambiente intracelular, as Galecti-30 nas podem participar de vias de sinalização e modular algumas respostas biológicas, como apoptose, regulação do crescimento celular e "pre-mRNA splicing" (processamento de RNA mensageiro).