Processo de obtenção de meio manutenção e crescimento celular, meio obtido e método de cultivo de células

  • Número do pedido da patente:
  • PI 1005032-9 A2
  • Data do depósito:
  • 30/12/2010
  • Data da publicação:
  • 01/03/1994
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 5/02
    C?lulas n?o diferenciadas de seres humanos, animais ou plantas, p. ex. linhagem de c?lulas; Tecidos; Sua cultura ou manuten??o; Seus meios de cultura; / Propaga??o de c?lulas individuais ou de c?lulas em suspens?o; Sua manuten??o; Seus meios de cultura;
    ;

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEIO DE MANUTENÇÃO E CRESCIMENTO CELULAR, MEIO OBTIDO, E, MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS. A presente invenção refere-se, de forma geral, ao uso da água de coco em pó (ACP) ou desidratada como meio de manutenção e/ou crescimento de células, preferencialmente para células clone C~6/36~ (Aedes albopictus).

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Documento

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Processo de Obtenção de Meio de Manutenção e Crescimento Celular, Meio Obtido, e, Método de Cultivo de Células

5 Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, de forma geral, ao uso da água de coco em pó (ACP) ou desidratada como meio de manutenção e/ou crescimento celular, preferencialmente para células C6/36 (Aedes albopictus). A presente invenção se situa no campo da biotecnologia.

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Antecedentes da Invenção

Antes de se reportar sobre a descrição da invenção faz-se necessário considerar e ressaltar os aspectos relevantes que justificam este meio: a dengue. Uma das doenças infecciosas de maior incidência nas regiões 15 tropicais e subtropicais do globo (Neto et ai, 2006). Pela dimensão que possui, tornou-se um grave e dramático problema de saúde global emergente, por colocar, sob ameaça, dois terços da população mundial e com registro da presença do vetor e de casos da doença em mais de cem países (Toledo et ai, 2006). Há uma luta histórica de décadas em esforços no combate a dengue, 20 mas todas as estratégias, até hoje implantadas, falharam ou são insuficientes porque não conseguiram frear a endemia e nem impedir o avanço e os danos gerados pelas sucessivas epidemias. O efeito expansionista e a carga do agravo são responsáveis por milhões de casos e óbitos, distribuídos, anualmente, em diversas nações.

25    O alto nível endêmico da doença está relacionado com a elevada

incidência domiciliar do Aedes aegypti(Teixeira et ai, 2005). Ressalta-se que o Aedes albopictus não tem sido incriminado pela transmissão da dengue no Brasil, mas tem competência de infectar-se ao se alimentar de sangue de hospedeiros humanos (Torres, 2005). Estudos demonstram que esta espécie, o 30 Aedes albopictus, é capaz de transmitir 22 arboviroses e, dentre as mais

importantes, estão a dengue e a febre amarela (Gubler et ai, 2001). Em meio à impotência e ao desespero das populações particularmente vulneráveis, a dengue impõe-se dizimando vidas, desafiando governos e o conhecimento científico. Essa conjuntura converge para a necessidade da renovação de esforços, incorporação de alternativas inovadoras, consequentes e efetivas e, conhecimentos que possibilitem o desenvolvimento de novas ferramentas de contribuição para prevenção e controle da dengue. A despeito dos esforços empreendidos ao longo de décadas, a dengue instiga a inteligência humana ao desafio de pesquisar inovações biotecnológicas em busca de soluções para essa emblemática doença.

Na agenda da pesquisa científica, ganham destaque as inovações biotecnológicas. E, nesta perspectiva, a água de coco concentra estudos, onde os resultados obtidos com a água de coco “in natura” e em pó (padronizada e estabilizada) garantem a conservação das características físico-químicas, simplificam o processo de utilização da mesma. Além disso, representa uma alternativa de inovação biotecnológica de impacto transformador no âmbito da ciência, pela disponibilidade, facilidade de conservação e transporte. Cabe assinalar que o estudo que proporcionou a padronização e estabilização da água de coco na utilização de processos biotecnológicos foi iniciado em 1997 e logrou êxito no início de 2002. (Salgueiro et ai, 2002). A água de coco é um produto oriundo de vegetações tipicamente tropicais, por isto, há limitações de sua utilização em regiões de clima temperado.

Dentro do eixo de análise, o fato da água de coco ser rica em nutrientes torna suscetível a contaminações e dificulta a conservação. O caráter estéril da água de coco é mantido no interior do fruto íntegro, no entanto, se torna susceptível a contaminação microbiana quando exposta ao ambiente por conta da abertura do fruto. Ressalta-se que a ação de enzimas presentes na água de coco é essencial para o fruto, mas em contato com o ar desencadeiam reações indesejáveis, principalmente provocando o desenvolvimento de coloração rosada ao endosperma líquido (Sobral, 2005).

O fruto coco (Cocos nucifera L.), pertence à subfamília Cocosidea, da família Palmea, produz a água que é uma solução natural e estéril, levemente ácida, contém proteínas, sais, açúcares, vitaminas e gorduras neutras (Marques, 1982). Há na sua composição fatores de crescimento como fito hormônios, no entanto, a água de coco é relativamente pobre em fosfolipídios (Laguna, 1996). Possui ainda, indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que conferem ao produto densidade e pH compatíveis com o do plasma sanguíneo (Blume e Marques Jr., 1994). Quando a água de coco é proveniente de frutos “in natura” com idade de seis meses (variedade verde da praia ou anão maduro) demonstra osmolaridade em torno de 500 mOsmol/Kg de H20 e pH entre 4.5 e 5.6.

Existem algumas dificuldades de ordem prática para a utilização da água de coco como meio conservante: seleção e disponibilidade de frutos com características ideais (fruto com seis meses de maturação) e problemas relacionados ao armazenamento do produto (Uchoa, 2004). Esses aspectos dificultam a identificação com exatidão do estágio de frutificação do fruto ideal para uso como conservante celular e, poucas pessoas estão aptas a realizar esse procedimento (Sobral, 2005). No âmbito das utilidades da água de coco destacam-se inúmeras evidências. Na virologia vegetal, a água de coco tem sido utilizada para o desenvolvimento de meristemas vegetativos e florais, cujo cultivo acontece através de um método de cura para plantas infectadas com vírus. E ainda, serve como fonte de fatores de crescimento para culturas de tecidos destinadas ao estudo da biossíntese de vírus vegetais (Prevot, 1968). A água de coco é recomendada contra icterícia e irritações gastrointestinais e estudos destacam atividade anti-helmíntica, tenicida e diurética (Gomes, 1977). Ao se utilizar a água de coco como meio sólido (adicionada de 2% de Agar), demonstra ser um bom meio de cultura para fungos, leveduras industriais, bactérias formadoras de ácidos, larvas da mosca-das-frutas, germinação de sementes de orquídeas e, quando alcalinizada é adequada para bactérias intestinais (Picado, 1942).

O processo de produção da água de coco na forma de pó passa por uma seqüência de procedimentos. De acordo com a finalidade do produto, é feita a seleção do fruto, em função das propriedades físico-químicas: volume, peso, diâmetro do albúmen, pH, osmolaridade, teor de carboidratos, teor de aminoácidos, teor de minerais, dentre outros. Após o processo de seleção do fruto ideal, é iniciada uma rigorosa higienização, para em seguida proceder à colheita do líquido endospérmico do coco (água de coco), sob forma asséptica, e com realização de amostragem, depois de feita a filtração. O líquido filtrado é homogeneizado, bombeado para o sistema de secagem, submetido a um tratamento térmico e a mostra seca é transformada em um pó, destituída de água livre, com alta solubilidade (Nunes etal., 2005).

O produto básico (líquido endospérmico do coco), em sua forma processada, (água de coco em pó) confere estabilidade e longevidade de prateleira, sem problemas de acondicionamento, e supera toda e qualquer tecnologia de conservação, devido manter todas as propriedades inerentes do produto original. A uniformidade do produto, obtida mediante rigoroso controle de processamento, em condições específicas, leva à manutenção dos valores agregados do endosperma líquido do coco (Nunes e Salgueiro, 2005b).

Os reflexos da aplicação da água de coco em pó em processos biotecnológicos resultaram numa relação de produtos que se encontram em fase experimental: meio para desenvolvimento de células germinais de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de manutenção, crescimento e maturação celular; meio de capacitação espermática de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de lavagem celular; meio de coleta, lavagem, cultivo, manutenção e criopreservação para embriões de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de criopreservação espermática de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de criopreservação de ovócitos de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de conservação e criopreservação de tecidos; meio de conservação e criopreservação de órgãos para transplante; meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e insetos; geles

associados à biopolímeros para uso médico e veterinário na elaboração de membranas de hidrogel substitutivas; produtos cerâmicos para próteses ósseas e dentárias; como biomaterial; produtos de confeitaria; bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais para 5 pacientes hospitalares; produtos cosméticos; juntamente com frutas e/ou verduras naturais, (ou seja, antes de ser transformada em pó, acrescenta-se a água de coco proporções variáveis de frutos e/ou verduras naturais, fazendo com que os valores nutricionais desses produtos sejam agregados aos da água de coco); meio de conservação para sêmen e para outros tipos celulares 10 (Nunes et ai, 2005).

No âmbito patentário, foram localizados alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir.

O documento US 2006/0134758 descreve um processo para se obter celulose bacteriana, compreendendo a etapa de se cultivar bactérias em um 15 meio que pode conter água de coco obtida in natura. O documento KR 970010602 descreve processo de obtenção de taxol compreendendo uma etapa de crescimento celular em um meio que contenha água de coco in natura. O documento JP 2222627 revela um processo de produção de plântulas de banana compreendendo a etapa de crescimento de tecidos de banana em meio 20 compreendendo água de coco in natura. A presente invenção difere destes documentos por compreender um meio de cultura de células à base de peptonas e água de coco modificada por liofilização (em pó), modificação que proporciona propriedades melhoradas de seus ácidos, se comparado com o uso da água de coco in natura.

25    Diante das evidências do potencial da água de coco em processos

biotecnológicos, com fundamento no alto custo econômico do meio de cultivo da célula clone C6/36 em laboratório, e com base na necessidade de aquisição do meio para desenvolvimento de pesquisas, buscou-se pesquisar um meio alternativo, efetivo e de baixo custo para atender à demanda. Esses 30 argumentos delineados com acuidade teórica, nas referências, resultaram na definição da invenção. Ressalta-se, ainda, que são conhecidos quatro métodos

de isolamento viral da Dengue: inoculação intracerebral em camundongos, inoculação em cultura de células de mamíferos, inoculação do vírus em mosquitos e a inoculação de amostras em cultura de células de mosquitos. Em relação à cultura de células de mosquitos, existem três linhagens que são 5 utilizadas para esta prática: clone de células C6/36 (Aedes albopictus), TRA 284 (Toxorhynchites amboinensis) e AP 61 (Aedes pseudoscutellaris). Evidências mostram que dentre estas linhagens citadas, o clone de células C6/36 do Aedes albopictus é a mais usada. O cultivo das células C6/36 em laboratório proporciona um método rápido e sensível para o isolamento do vírus da ío Dengue. Os antígenos do vírus presentes nas culturas de células infectadas podem ser detectados através da imunofluorescência indireta que é uma técnica sensível, permite processar um grande número de amostras ao mesmo tempo e se tornou padrão para isolamento viral (De Paula e Fonseca, 2004).

Baseado em estudo da composição da água de coco em pó, atentou-15 se pela necessidade de suplementação do meio de crescimento de células com fontes nitrogenadas. As mais utilizadas são a peptona de soja e a peptona de caseína.

A peptona de soja é recomendada nos seguintes meios: ágar-caldo eugonico (para cultivo de microorganismos exigentes), meio tioglicolado (para o 20 cultivo de microorganismos anaeróbicos, de difícil nutrição), meio triptona de soja (para uso geral em exames de importância sanitária/higiênica), e meio fungai (para uso geral no cultivo de leveduras e bolores). Contém em suas especificações: nitrogênio total: 9,5%; nitrogênio a-amino: 2,0%; umidade máxima: 5,0%; cinzas: 13,0%; cloreto de sódio: 4,0%; metais pesados (como 25 chumbo): 0,0029%; carboidrato: 31,0%; pH (1% de solução): 6.4 + 0.5.

A peptona de caseína é uma caseína de digestão pancreática designada para a incorporação dentro de uma grande variedade de formulações de meio de cultura para o crescimento de todos os tipos de microorganismos fatídicos e não-fatídicos. Contém em sua composição, em 30 g/L: nitrogênio total máximo: 12,2%; cloreto de sódio máximo: 3,3%; perda na

secagem máxima 4,0%; resíduo na ignição máximo: 3,5%. A solução aquosa a 1 % tem pH 7.18 a 25°C.

Quanto aos meios de cultura desprovidos de material de origem animal, eles geralmente são provenientes de matérias-primas ricas em proteínas tais 5 como, por exemplo, as matérias-primas cerealíferas como arroz (W098/15614; WO 99/57246) ou o trigo. A título de exemplo de outras matérias-primas utilizadas, pode igualmente citar a soja (WO 01/23527; WO 00/03000), ou ainda o pepino (WO 99/47648). Entretanto, tais meios de cultura são relativamente onerosos para obter e são geralmente provenientes de matérias-ío primas com alto potencial protéico, podendo ser utilizadas para outras aplicações, como, por exemplo, aplicações alimentares. Existe então uma real necessidade de desenvolver meios de manutenção e crescimento celular completamente desprovidos de produtos de animais e de baixos custos ou, no mínimo, provenientes de matéria-prima pouco valorizada e/ou valorizável.

15    A presente invenção se propõe a paliar a carência da arte anterior,

propondo um meio de cultura desprovido de soro e obtido a partir de uma matéria-prima vegetal de baixo teor protéico inicial.

Mais particularmente, a presente invenção trata da utilização de um extrato peptídico para a preparação e/ou suplementação de meio de 20 manutenção e crescimento de células clone Cô/36 (Aedes albopictus), sem soro animal, sendo obtidos de uma matéria-prima vegetal, caracterizado pelo fato da matéria-prima ser água de coco em pó, suplementada com peptonas. Naturalmente, esta enumeração não é de nenhuma forma limitativa e qualquer tipo de células pode ser englobada pela presente invenção.

25    Essas referências sistematizam e distinguem o caráter da invenção e no

que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade, atividade inventiva e aplicabilidade frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de água de coco desidratada como meio de manutenção e/ou crescimento de células. A novidade da presente invenção está centrada no fato de que se utiliza de um composto recentemente desenvolvido, a água de coco desidratada, como meio 5 de manutenção e/ou crescimento, dada suas vantagens quanto à durabilidade, quando comparada à água de coco in natura e a outros meios convencionais.

É um dos objetos da presente invenção o processo de obtenção de meio de manutenção e crescimento celular compreendendo as etapas de:

a) obter a água de coco em pó;

10    b) suplementar a água de coco em pó com reguladores de pH;

c)    suplementar a água de coco em pó com fontes nitrogenadas;

d)    diluir em água ultra pura (Milli-Q) ou bidestilada ou destilada;

Em uma realização preferencial, o meio é fitrado, preferencialmente em

uma membrana.

15    É um objeto da presente invenção o meio de manutenção e crescimento

para células clone C6/36 (Aedes albopictus) obtido pelo processo acima descrito.

Em uma realização preferencial, o meio se destina a células clone C6/36 (Aedes albopictus).

Em uma realização preferencial, o meio compreende pH entre 7,0 e 7,4,

20 preferencialmente 7,2.

Em uma realização preferencial, o meio compreende osmolaridade entre 280 mOsm/Kg H2O e 320 mOsm/Kg H20, preferencialmente 300 mOsm/Kg H20.

É um objeto adicional da presente invenção 0 método de manutenção e

25 crescimento de células, compreendendo as etapas de:

a)    obter o meio de manutenção e crescimento de acordo com o processo descrito acima;

b)    inocular o meio de (a) com material biológico;

c)    manter em estufa de cultivo;

30    d) realizar repiques de células para manutenção das culturas

celulares monocamadas confluentes.

Em uma realização preferencial, o material biológico de (b) são células clone C6/36 (Aedes albopictus).

Em realização preferencial, as fontes nitrogenadas da presente invenção compreendem peptonas.

5    Em realização preferencial, o meio de manutenção e crescimento da

invenção compreende 1,58% de fontes nitrogenadas, sendo 0,84% de peptona de caseína e 0,74% de peptona de soja.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão ío descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.