Método de detecção de mycobacterium tuberculosis e kit de diagnóstico de tuberculose

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0900612-5 A2
  • Data do depósito:
  • 13/02/2009
  • Data da publicação:
  • 28/06/2011
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/50
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos;
    ;

MÉTODO DE DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E KIT DE DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE. A presente invenção consiste em um método para detecção de M. tuberculosis e um kit para o diagnóstico de tuberculose. Particularmente, o referido processo e kit são baseados na detecção em amostras clínicas pulmonares e extrapulmonares de pacientes com tuberculose.

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Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Método de Detecção de Mycobacterium tuberculosis e Kit de Diagnóstico de tuberculose

5 Campo da Invenção

A presente invenção consiste em um método de detecção de Mycobaterium tuberculosis e um kit para o diagnóstico de tuberculose. Particularmente, o referido processo e kit são baseados na detecção em amostras clínicas pulmonares e extrapulmonares de pacientes com 10 tuberculose. A presente invenção é particularmente útil em setores médicos (oncologia clínica e laboratorial), laboratórios de biologia molecular e biotecnologia, laboratórios de análises clínicas, laboratórios de citopatologia, hospitais, instituições de pesquisa, universidades e na indústria farmacêutica.

15 Antecedentes da Invenção

Mycobaterium tuberculosis

Estimativas da Organização Mundial de Saúde (WHO) mostram que cerca de um terço da população está infectada com Mycobacterium tuberculosis (MTB), sendo que 9,2 milhões de novos casos e cerca de 3 20 milhões de mortes ocorrem por ano.

A interação inicial entre o microorganismo e o hospedeiro influencia o andamento da infecção, sendo que o estudo da expressão gênica do microorganismo é fundamental para o conhecimento aprofundado do mesmo e, consequentemente, a criação de novos métodos de diagnóstico/tratamento da 25 tuberculose.

Diagnóstico

Os diagnósticos realizados em laboratório da tuberculose são ainda insatidfatórios, e isso prejudica a rápida intervenção terapêutica, uma vez que os kits de diagnóstico atuais, baseados em métodos bioquímicos ou meios de 30 cultura, não garantem o tratamento médico em tempo hábil, e que as colônias de M. tuberculosis só são visíveis após 10-24 dias de cultura e a baciloscopia é

inespefífica. A bactéria cresce lentamente in vitro e o método tem as desvantagens de ser muito demorado e de difícil execução, uma vez que necessita de procedimentos especiais de biosegurança. Recentemente, algumas técnicas de biologia molecular também foram desenvolvidas, como 5 análise de PCR de fragmentos específicos para detectar a presença do genoma de MTB, ou hibridização usando sondas de DNA, que são técnicas que requerem seqüências espécies-específicas para a identificação de microorganismos e diagnóstico de tuberculose.

A literatura patentária analisada não antecipa e nem sugere, ainda que 10 indiretamente, qualquer dos objetos da presente invenção.

O documento WO 07/140545 descreve métodos de diagnóstico e tratamento de M. tuberculosis compreendendo a identificação de proteínas isoladas ou recombinantes putativas EFTu (Fator de Elongamento Tu) utilizando, por exemplo, ELISA. A presente invenção difere desse documento 15 por não identificar especificamente EFTu.

O documento WO 06/008760 descreve métodos de diagnóstico de tuberculose compreendendo a detecção de anticorpos isocitrato desidrogenase, anti-Mycobaterium tuberculosis. A presente invenção difere desse documento por não compreender a detecção de anticorpos anti-20 Mycobacterium tuberculosis.

O documento WO 05/021790 descreve o uso de seqüências gênicas específicas, que pertenciam a uma região de deleção de M. bovis BCG para a detecção de M. tuberculosis utilizando técnicas conhecidas, como PCR e/ou ELISA. A presente invenção difere desse documento por não identificar BCG.

25    A presente invenção difere dos documentos citados acima por

compreender uma sonda específica, aminada, não descrita nos referidos documentos. Essa sonda é capaz de hibridizar especificamente no material biológico de Mycobacterium tuberculosis, permitindo a sua detecção e, consequentemente, o diagnóstico de pacientes infectados com esse 30 microorganismo, como no caso da tuberculose.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

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Sumário da Invenção

A presente invenção um método novo e melhorado para detecção de Mycobacterium tuberculosis (bacilo causador da tuberculose).

É, portanto, um objeto da presente invenção um método para detecção 10 de Mycobacterium tuberculosis compreendendo as etapas de:

a)    identificar e/ou extrair e/ou purificar o material biológico de uma amostra;

b)    amplificar o material biológico de a) referente à Mycobacterium tuberculosis;

15    c) hibridizar os produtos amplificados de b) com uma sonda

específica de SEQ N°1, aminada na porção 5', e/ou materiais biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda, imobilizada em uma placa de ELISA;

d) detectar o produto amplificado.

20    Em uma realização preferencial, o método para detecção de

Mycobacterium tuberculosis compreende as etapas de:

a)    identificar e/ou extrair e/ou purificar um material biológico de uma amostra clínica utilizando resina de sílica;

b)    produzir amplicons a partir da amplificação de uma região alvo

25    utilizando PCR;

c)    hibridizar o material biológico de b), compreendendo:

c1) desnaturação dos amplicons;

c2) ligar os amplicons às sondas aminadas reconhecedoras específicas de SEQ N°1, aminadas na porção 5', e/ou materiais 30    biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda,

imobilizada em uma placa de ELISA;

d) detectar o material biológico compreendendo as etapas de:

d1) utilizar um material biológico de detecção que se ligue no complexo formado entre os amplicons e as sondas fixadas na placa de ELISA;

5    d2) adicionar um substrato químico;

d3) adicionar uma solução de parada.

Em uma realização opcional, o referido método compreende a etapa adicional de leitura do material detectado utilizando um leitor de ELISA com filtro de 450 nrn.

10    Em uma realização preferencial, a região alvo.é uma região de 245 pb

do elemento IS 6110 de M. tuberculosis.

Em uma realização preferencial, o material biológico de detecção é a streptavidina peroxidase.

Em uma realização preferencial, o substrato químico é o 3,3', 5,

15 5'tetrametilbenzidina (TMB).

É um adicional objeto da presente invenção um kit para diagnóstico de tuberculose compreendendo:

a) meios para identificar e/ou extrair e/ou purificar o material biológico de uma amostra;

20    b) meios para amplificar o material biológico de a) referente à

Mycobacterium tuberculosis;

c)    meios para hibridizar os produtos amplificados de b) com uma sonda específica de SEQ N°1, aminada na porção 5', e/ou materiais biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda, imobilizada

25    em uma placa de ELISA em uma placa de ELISA;

d)    meios para detectar o produto amplificado.

Em uma realização preferencial, os meios para amplificar o material biológico de uma amostra compreendem a técnica de PCR.

Em uma realização preferencial, os meios para detectar o produto

30 amplificado compreendem materiais biológicos de detecção, substratos químicos e/ou soluções de parada.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

5 Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção será exposta a seguir em detalhes. Os exemplos descritos a seguir são meras concretizações preferenciais da invenção, não devendo ser compreendidos como limitantes de invenção. Variações ou concretizações similares devem ser consideradas como dentro do escopo da 10 invenção.

Material Biológico

O material biológico útil na presente invenção inclui, mas não se limita aos elementos como DNA, RNAs e/ou proteínas, inteiros ou parciais, 15 encontrados em células e/ou tecidos e/ou órgãos de um organismo eucarioto. Em especial, o material biológico utilizado na presente invenção para a detecção é o DNA.

Em especial, . o material biológico de Mycobacterium tuberculosis utilizado é uma região de 245 pb do elemento IS6110 deste microorganismo.

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Método para detecção

O método para detecção de Mycobacterium tuberculosis compreende as etapas de:

a)    identificar e/ou extrair e/ou purificar o material biológico de uma

25    amostra;

b)    amplificar o material biológico de a) referente à Mycobacterium tuberculosis;

c)    hibridizar os produtos amplificados de b) com uma sonda específica aminada de SEQ N° 1 e/ou materiais biológicos com mais que

30    95% de identidade com a sonda, imobilizada em uma placa de ELISA;

d)    detectar o produto amplificado.

Em uma realização preferencial, o método para detecção de Mycobacterium tuberculosis compreende as etapas de:

a) identificar e/ou extrair e/ou purificar um material biológico de uma amostra clínica utilizando resina de sílica;

5    b) produzir amplicons a partir da amplificação de uma região alvo

utilizando PCR;

c)    hibridizar o material biológico de b), compreendendo:

c1) desnaturação dos amplicons;

c2) ligar os amplicons às sondas aminadas reconhecedoras 10    específicas de SEQ N° 1 imobilizadas em placas de ELISA;

d)    detectar o material biológico compreendendo as etapas de:

d1) utilizar um material biológico de detecção que se ligue no complexo formado entre os amplicons e as sondas fixadas na placa de ELISA;

15    d2) adicionar um substrato químico;

d3) adicionar uma solução de parada.

Resina de Sílica

A Resina de Sílica, que será utilizada no protocolo de extração de DNA 20 de M. tuberculosis de amostras clínicas, será preparada como descrito por Boom e colaboradores (1990). Para tanto, os reagentes necessários serão: Dióxido de Silício (SÍO2), Ácido Clorídrico (HCI) e água desmineralizada.

Primeiramente, 60g de Dióxido de Silício serão colocados em 500mL de água desmineralizada. Após agitação vigorosa, o preparado será deixado 25 sedimentando por 24 horas a temperatura ambiente. O sobrenadante (430mL) então deverá ser retirado por sucção e novamente deverá ser adicionado o volume para completar 500mL de água desmineralizada. O pellet de sílica deverá ser ressuspendido através de vigorosa agitação e deixado novamente sedimentando por 24 horas a temperatura ambiente. O sobrenadante deverá 30 ser novamente retirado (440mL) e o pH ajustado para 2,00 adicionando-se

600|j.L de HCI. Depois de pronta, a resina deverá ser autoclavada e poderá ser estocada em geladeira, no escuro por até seis meses (BOOM et.al, 1990).

Kit para Diagnóstico

5    O referido kit compreende, preferencialmente:

a)    meios para identificar e/ou extrair e/ou purificar o material biológico de uma amostra;

b)    meios para amplificar o material biológico de a) referente à Mycobacteríum tuberculosis]

10    c) meios para hibridizar os produtos amplificados de b) com uma

sonda específica imobilizada de SEQ N° 1 em uma placa de ELISA; d) meios para detectar o produto amplificado.

Em uma realização preferencial, o material celular é o DNA e os meios, 15 para a obtenção do dito DNA podem ocorrer por um grande número de variações metodológicas. Em uma de suas concretizações, pode ser utilizado reativos/técnicas como PCR, ambos já conhecidos do estado da técnica.

A etapa de extração e/ou identificação e/ou purificação útil na presente invenção inclui qualquer técnica já utilizada direcionada ao material biológico 20 de escolha.

Exemplos de técnicas incluem, mas não se limitam, técnicas corriqueiras de biologia molecular como PCR.

Na técnica de PCR, amplamente conhecida do meio científico, o material genético é desnaturado e primers se ligam à eles, permitindo a amplificação do 25 material genético, como DNA previamente extraído e purificado. Após essa amplificação, é possível verificar e comparar a expressão dessa molécula pela análise de géis.

Exemplo 1 - Processo in vitro para diagnóstico de Mycobacteríum 30    O processo revelado nesta concretização preferencial da invenção

compreende as seguintes etapas:

1)    Extração do DNA do M. tuberculosis do material clínico utilizando uma primeira etapa de lise celular que rompe a célula bacteriana com posterior liberação do DNA de seu interior. A segunda etapa na preparação da amostra consiste em purificar o DNA, que possivelmente esteja presente, removendo substâncias encontradas usualmente em materiais clínicos, que podem atuar como inibidores da Taq DNA polimerase no processo subseqüente de amplificação.

2)    Amplificação pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de uma região "alvo" de 245 pb (pares de bases) correspondente ao elemento IS6110 do DNA genômico do Mycobacterium tuberculosis. A mistura de reagentes da PCR, que contém a amostra de DNA, é aquecida, expondo as seqüências alvo do iniciador específico. Á medida que a mistura vai arrefecendo, os iniciadores biotinilados ligam-se aos seus alvos. A enzima polimerase estende os iniciadores a partir do molde alvo, produzindo uma seqüência de DNA biotinilado denominada de amplicon. Este processo é repetido por uma série de ciclos, em que cada ciclo duplica efetivamente a quantidade de DNA alvo.

3)    Reação de Hibridização: após o processo de amplificação por PCR, os amplicons são desnaturados e adicionados a uma placa de ELISA que contém uma sonda específica da seqüência IS6110. Os amplicons se ligam a sonda que contém uma seqüência alvo complementar, sendo assim “capturados” na placa. Etapas de lavagens asseguram a especificidade da reação, removendo todo amplicon não ligado.

4)    Reação de Detecção: o complexo da sonda com o amplicon é visualizado por intermédio de uma reação colorimétrica. O conjugado streptavidina peroxidase (SP) é adicionado à placa, ligando-se aos amplicons marcados pela biotina e capturados pela sonda. A adição do substrato TMB resulta na formação de um complexo de cor azul, na presença do conjugado SP. Posteriormente, uma Solução de parada é adicionada, conferiando uma coloração amarelada à reação.

Tabela 1 - Descrição Detalhada dos Componentes

N2 Produtos

Quantidade

1 Resina de sílica

250 pL

Solução tampão (ST)*

2 (Contém TRIS e EDTA)*

20 mL

3 Solução de Lise

12 mL

4 Solução Mix-PCR 4 frascos com 1 mL cada

4 mL

5 Reagente de Lavagem A (LVA)

50 mL

6 Reagente de Lavagem B (LVB)

25 mL

7 Reagente de Hibridização (RH)*

12 mL

8 Reagente de Lavagem 1 (RL1)*

250 mL

9 Reagente de Lavagem 2 (RL2)*

250 mL

10 Solução de Parada (Ácido Sulfúrico 0,1M) -não fornecido pelo kit

12 mL

11 Conjugado Enzimático - Streptavidina Peroxidase (SP)

12 mL

12 TMB (3,3',5,5'Tetramethylbenzidine)

12 mL

13 Placas (12 strips para 8 análises cada)

12 strips

Controle positivo da reação estoque (CPR) (10 fg/reação) 14 DNA de Mycobacterium tuberculosis

100 pL

Controle positivo da extração (CPE). 10 frascos com 100 pL cada

Cada 100 pL contém uma suspensão bacteriana inativada DNA de Mycobacterium tuberculosis correspondendo a 50

15 UFC (unidades formadoras de colônias)    i mL

16 Controle negativo da reação (CNR)

1000 pL

17 Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan mono-laurate)

500 pL

* formulação exclusiva do fornecedor

Exemplo 1.1 - Extração de DNA

1. Preparar o controle CNE.

5    2. Calcular o volume de ST e Soluções de Lavagens a serem

utilizadas de acordo com o número de amostras (não esquecer CNE) e separar em frasco estéril.

3.    Colocar o tubo do controle CNE, CPE e amostras na centrífuga e centrifugar por 10 minutos a 13.000 rpm (orientar o tubo na centrífuga com relação ao material a ser sedimentado).