Método de detecção de mycobacterium tuberculosis e kit de diagnóstico de tuberculose

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0900612-5 A2
  • Data do depósito:
  • 13/02/2009
  • Data da publicação:
  • 28/06/2011
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/50
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos;
    ;

MÉTODO DE DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E KIT DE DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE. A presente invenção consiste em um método para detecção de M. tuberculosis e um kit para o diagnóstico de tuberculose. Particularmente, o referido processo e kit são baseados na detecção em amostras clínicas pulmonares e extrapulmonares de pacientes com tuberculose.

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Documento

4.    Em cabine de fluxo laminar, retirar o sobrenadante de cada

5    amostra e dos controles com micropipeta com ponteira com filtro

5.    Adicionar a todos os tubos 100 pL de Solução de Lise (SL) usando ponteira com filtro. Colocar as amostras a 100°C por 10 min.

6.    Homogeneizar a resina de sílica e adicionar 2,5 pL desta em cada um dos microtubos novos previamente numerados, (usar ponteira com

10    filtro)

7.    Centrifugar todos os tubos por 1 minuto a 13.000 rpm (etapa 5).

8.    Retirar o sobrenadante e transferir para o microtubo contendo a resina, homogeneizar com a ponteira.

9.    Centrifugar todos os tubos por 1 minuto a 13.000 rpm.

15    10. Retirar o sobrenadante com ponteiras novas com filtro, trocando

a ponteira para cada amostra.

11.    Adicionar 20ÒpL de Solução de Lavagem A, homogeneizar em vortex.

12.    Repetir o passo 9 e 10 e 11.

20    13.    Repetir    os passos    9 e 10.

14.    Adicionar 200pL de Solução de Lavagem B, homogeneizar em vórtex.

15.    Centrifugar todos os tubos por 1 minuto a 13.000 rpm.

16.    Retirar o sobrenadante, e colocar os tubos fechados a 56°C por

25    10 min.

17.    Abrir os tubos dentro da capela de fluxo laminar e deixar secar por 5 min.

18.    Adicionar 33 pL de solução tampão em cada tubo. Homogeneizar em vortex, colocar em banho 56°C por 10 min.

30    19.    Centrifugar 1    minuto a    13.000 rpm.

20.    Transferir o sobrenadante (usando ponteira com filtro) para microtubos de 0,5 mL previamente identificados, (cuidar para não misturar o sobrenadante com a resina)

21.    Armazenar os DNAs extraídos a -20°C até o momento de processar a PCR.

Exemplo 1.2- Reação de PCR

1.    Descongelar o CNR e a MIX-PCR, em local apropriado.

2.    Identificar os microtubos de reação de acordo com as amostras, incluindo os controles CPR e CNR.

3.    Aliquotar 40 pL da MIX-PCR em todos os microtubos, previamente identificados.

4.    Adicionar 10 pL de controle negativo de reação no microtubo denominado CNR.

5.    Transportar os microtubos fechados até a área de pipetagem do DNA na MIX-PCR

Exemplo 1,3- Adição das amostras na MIX-PCR (em câmara de fluxo laminar/ ou capela com UV (local diferente de onde foi realizada a extração)

1.    Adicionar 10 pL de amostra (DNA previamente extraído) em cada microtubo contendo a MIX-PCR, previamente identificados, bem como 10 pL do CPR.

2.    Colocar os tubos no termociClador e programar as condições de amplificação descritas abaixo. Optar pelo uso da placa de aquecimento {hot bonnef).

3.    Após o término da PCR, guardar os microtubos em freezer até o momento da hibridização e detecção.

Tabela 2 - Condições de Amplificação

Desnaturação    94 °C, 2 minutos

Anelamento

68 °C, 2 minutos

Extensão

72 °C, 2 minutos

Número de ciclos

35

Estabilização e parada de reação

4°C

Exemplo 1.4- Hibridização e Detecção

1. Numerar os strips da placa a ser utilizada e fazer .um mapa das amostras que serão detectadas.

5    2. Desnaturar o produto amplificado de cada amostra durante 6 minutos

a 100°C, após colocar as amostras diretamente no gelo.

3.    Preparar a solução de hibridização (SH) - Colocar o volume de 100 pL de solução em cada poço da placa (identificar os locais).

4.    Adicionar 30 pL do produto amplificado correspondente, previamente

10 desnaturado.

5.    Selar a placa, manter a 50°C, durante 45 minutos.

6.    Aspirar a solução da placa.

7.    Lavar a placa 3 vezes com 300pL solução de lavagem 1.

8.    Adicionar 300pL da Solução de Lavagem 1 pré-aquecida a 50°.

15    9. Cobrir a placa e colocar a 50°C por 15 minutos.

10. Lavar a placa 3 vezes com 300pL solução de lavagem 1.

11 .Adicionar 100 pL do conjugado Streptavidina Peroxidase (SP).

12. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 30 min.

13. Lavar a placa 3 vezes com 300pL Solução de Lavagem 2.

20    14. Adicionar 300pL de Solução de Lavagem 2 e deixar por 5 minutos a

temperatura ambiente.

15.    Lavar a placa 3 vezes com 300pL Solução de Lavagem 2.

16.    Adicionar 100 pL do substrato TMB.

17.    Incubar por 15 min a temperatura ambiente.

25    18. Adicionar 100 pL de Solução de Parada e ler a placa em Leitora de

ELISA utilizando comprimento de onda de 450 nm e refiltro 620nm.

Exemplo 1.5 - Análise dos resultados

Inicialmente o método de extração de DNA das amostras clínicas era realizado conforme descrito por ROSSETTI et al., (1997), utilizando-se na 5 etapa de purificação do DNA uma resina comercial (Sephaglas ™, Band -Prep Kit, Amersham Pharmacia Biotech). Atualmente este foi aperfeiçoado, a etapa de extração do DNA do Mycobacterium tuberculosis passou a ser realizada através da lise da parede celular por fervura com o auxílio de uma Solução de Lise. Após, o DNA extraído, é purificado com a utilização da resina de sílica 10 preparada conforme Boom et al., (1990), para posterior amplificação utilizando a PCR.

Tabela 3 - Verificação dos controles e Amostras CPE / CPR / Amostras positivas

Presença de coloração inicialmente azul posteriormente amarela (após colocação da solução de parada). A leitura em ELISA filtro 450 nm e refiltro 620 nm deverá ser observada (10% acima do valor do “cut off’ (0,250)/ >0,275) CNE CNR Amostras negativas

Ausência de coloração. Ã leitura em ELÍSÃ filtro 450 nm e refiltro 620 nm deverá ser observada (10% abaixo do valor do “cut off’ (0,250)/ < 0,225)

Zona Cinza (Amostras que deverão ser repetidas com leitura entre 0,225 e 0,275)

15    O experimento referente ao teste com o protocolo padronizado e os

resultados referentes, seguem abaixo:

Tabela 4 - Experimentos realizados com a resina e reagentes - Protocolos para teste

1-    Utilizar o 500 nL de amostra (diluições de M.tuberculoses)_

2-    Centrifugar 10 min 13.000 rpm, retirar o sobrenadante_

3-    Ressuspender em 100 jxL de Solução de Lise ( utilizar vortex) e colocar a 100°C

por 10 min____

4-    Centrifugar 1 min, 13.000 rpm, transferir o sobrenadante para novo tubo contendo

2,5pL de Resina de Sílica e homogeneizar_

5-    Centrifugar 1 min a 13.000 rpm, retirar o sobrenadante_.

6-    Ressuspender em 200mL de Solução de Lavagem 1 (utilizar vortex)_

7-    Repetir os passos 5 e 6__

8-    Centrifugar 1 min a 13.000 rpm, retirar o sobrenadante_

9-    Ressuspender em 200pL de Solução de Lavagem 2 (utilizar vortex)_

10-    Centrifugar 1 min a 13.000 rpm, retirar o sobrenadante_

11 - Colocar os tubos a 56°C com tampas fechadas por 10 min _

12-    Deixar os tubos com as tampas abertas por 5 min a temperatura ambiente_

13-    Adicionar 33 u.L do tampão TE e deixar 10 min 56°C_

14-    Centrifugar por 1min a 13.000 rpm_

15-    Retirar os 30 pL do sobrenadante e transferir para novo tudo_


Soluções:

(1) . Resina (pó) Dióxido de Sílica / SIGMA - preparado segundo Boom et al. (1990)*

(2) . Solução de Lavagem 1 Gu HCI 8M/ Tris 0,08N

5    (3). Solução de Lavagem 2 EtOH 70%

(4). Solução de Lise Gu HCI 8M/ Tris 0,08N / EDTA + Triton

Resultados observados:

10    Após a eletroforese em gel de agarose 1,5%, os controles negativos da

extração e reação não apresentaram nenhum sinal de amplificação, sendo que os controles positivos da extração e reação apresentaram um sinal de amplificação conforme esperado. O mesmo ocorrendo com as amostras correspondendo às diluições -1 a -5. Portanto a sensibilidade analítica da 15 técnica correspondeu a 50 UFC (unidades formadoras de colônias).

Experimentos realizados com diferentes quantidades de resina

O protocolo referente à extração foi testado com diferentes quantidades de resina: 2,5 pL, 5 pL e 7,5 pL (etapa 4/protocolo para teste).

20

Resultados observados:

A eletroforese em gel de agarose demonstrou que a quantidade de 2,5 pL apresentou melhores resultados, pois o sinal de amplificação estava presente até a diluição -5, limite da sensibilidade analítica (50UFC).

Posteriormente, a extração padronizada foi conduzida em amostras clínicas, positivas, negativas e contaminadas com as diluições seriadas.

Protocolo de detecção em microplacas de Elisa 5    Para a padronização do protocolo colorimétrico, foram utilizadas

diluições seriadas de DNA de M. tuberculosis amplificado por PCR. O protocolo será desenvolvido conforme descrito pelo fabricante das placas que serão utilizadas no procedimento (Nunc™, NucleoLink™).

A detecção do DNA amplificado de M. tuberculosis será feita conforme 10 protocolo NucleoLink™ (Nunc™, NucleoLink™). Para tanto, as soluções a serem utilizadas são: Solução de Hibridização (SSC 5x, BSA e Tween 20), Solução de Lavagem 1 (SSC 0,5X e Tween 20), Solução de Lavagem 2 (Tris HCI, NaCI e Tween 20), Conjugado Estreptavidina Peroxidase, Substrato TMB e Solução de Parada (H2S04).

15    Para a detecção, os DNAs amplificados são desnaturados por 5 minutos

a 100°C, e posteriormente mantidos no gelo. É adicionado 100pL da solução de hibridização no poço da microplaca, e mais 30^L do DNA amplificado desnaturado. A placa então deverá ser fechada com adesivo e colocada a 50°C por 45 minutos. Posteriormente, a placa será lavada três vezes com a Solução 20 de Lavagem 1 (0,1 % Tween 20, 0,5X SSC) deixada por 15 minutos a 50° com a Solução de Lavagem 1 pré aquecida a 50°C e lavada mais três vezes com a mesma solução. O Conjugado Enzimático deverá ser adicionado e a placa colocada a 37°C por 30 minutos. A placa deverá ser lavada três vezes com a Solução de Lavagem 2 (100 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, 0,1% Tween), 25 deixada a temperatura ambiente por 5 minutos com a mesma solução e posteriormente lavada mais 3 vezes. O substrato TMB (3,3',5,5'tetramethylbenzidine) deverá ser adicionado e deixado a temperatura ambiente por 15 minutos. Então deverá ser adicionada a Solução de Parada (0,1M H2SO4). Posteriormente a microplaca estará pronta para ser lida em 30 Leitora de ELISA no comprimento de onda de 450nm com refiltro de 620nm.

Resultados observados:

Foram testadas amostras negativas para presença de Mycobacterium tuberculosis. A tabela abaixo apresenta a interpretação das leituras (controles e amostras) realizadas em equipamento “Leitor de ELISA” no comprimento de 5 onda de 450 nm e refiltro 620 nm:

Os versados na arte valorizarão imediatamente os importantes benefícios decorrentes do uso da presente invenção. Variações nas formas de concretizar o conceito inventivo aqui exemplificado devem ser compreendidas como dentro do espírito da invenção e das reivindicações anexas.

Listagem de Seqüências

Dados do requerente:

(a)    Nome: Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)

(b)    Endereço: Av. Paulo Gama, 110, Porto Alegre, RS, 90046-900.

(c)    Nome: Fundação Estadual de Proteção e Pesquisa em Saúde (FEPPS)

(d)    Endereço: Av. Ipiranga, 5400, Porto Alegre, RS, 90610-000.

(e)    Nome: Leonides Rezende Junior

(f)    Endereço: Rua Francisco Deslandes, 680, Apto. 1201, Belo Horizonte, MG, 30310-530.

Título da Invenção: MÉTODO DE DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E KlT DE DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE

Número de sequências constantes do pedido: 1

Seq. n° 1

Tamanho: 28 pares de bases Tipo: DNA

Função: Sonda molecular (5'-3')

tttttttttt gcccgtcccg ccgatctc 28

Reivindicações

Método de Detecção de Mycobacterium tuberculosis e Kit de

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE

1.    Método para detecção de Mycobacterium tuberculosis caracterizado por compreender as etapas de:

a)    identificar e/ou extrair e/ou purificar o material biológico de uma amostra;

b)    amplificar o material biológico de a) referente à Mycobacterium tuberculosis;

c)    hibridizar os produtos amplificados de b) com pelo menos uma sonda específica de SEQ N° 1, aminada na porção 5', e/ou materiais biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda, imobilizada em uma placa de ELISA;

d)    detectar o produto amplificado.

2.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pela extração e/ou purificação do material biológico de uma amostra clínica utilizar resina de sílica.

3.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pela ahnplificação do material biológico compreender a produção de amplicons a partir da amplificação de uma região alvo utilizando PCR.

4.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    3,

caracterizado pela região alvo ser uma região de 245 pb do elemento IS 6110 de M. tuberculosis.

5.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pela hibridização do material biológico compreender as etapas de:

a)    desnaturação dos amplicons;

b)    ligar os amplicons às sondas aminadas reconhecedoras específicas de SEQ N° 1, aminadas na porção 5', e/ou materiais

biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda, imobilizada em uma placa de ELISA.

6.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pela detecção do material biológico compreender as etapas de:

5    a) utilizar um material biológico de detecção que se ligue no

complexo formado entre os amplicons e as sondas fixadas na placa de ELISA;

b)    adicionar um substrato químico;

c)    adicionar uma solução de parada.

10    7.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pelo material biológico de detecção ser a enzima estreptavidina peroxidase.

8.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado pelo substrato químico ser 3,3', 5, 5'tetrametilbenzidina (TMB).

15    9.    Método    para    detecção,    de    acordo    com    a    reivindicação    1,

caracterizado por opcionalmente compreender a etapa adicional de leitura do material detectado utilizando um leitor de ELISA com filtro de 450 nm e refiltro em 620 nm.

10.    Kit para diagnóstico de tuberculose caracterizado por compreender:

20    a) meios para identificar e/ou extrair e/ou purificar o material

biológico de uma amostra;

b)    meios para amplificar o material biológico de a) referente à Mycobacterium tuberculosis;

c)    meios para hibridizar os produtos amplificados de b) com pelo

25    menos uma sonda específica de SEQ N° 1, aminada na porção 5', e/ou

materiais biológicos com mais que 95% de identidade com a sonda, imobilizada em uma placa de ELISA;

d)    meios para detectar o produto amplificado.

11.    Kit para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 10, 30 caracterizado pelos meios para amplificar o material biológico de uma amostra

compreender a técnica de PCR.

12.    Kit    para    diagnóstico,    de    acordo    com    a    reivindicação    10,

caracterizado pelos meios para detecção do produto amplificado compreenderem materiais biológicos de detecção, substratos químicos e/ou soluções de parada.

5    13. Kit para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 10,

caracterizado pela extração e/ou purificação do material biológico de uma amostra clínica utilizar resina de sílica.

14.    Kit    para    diagnóstico,    de    acordo    com    a    reivindicação    10,

caracterizado pela amplificação do material biológico compreender a produção

10 de amplicons a partir da amplificação de uma região alvo    utilizando PCR.

15.    Kit    para    diagnóstico,    de    acordo    com    a    reivindicação    14,

caracterizado pela região alvo ser uma região de 245 pb do elemento IS 6110 de M. tuberculosis.