Cepa do vírus da dengue-1 vivo atenuado, composição imunogênica, composição de vacina, ácido nucléico isolado, poliproteína isolada e fragmento de poliproteína

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0613328-2 A2
  • Data do depósito:
  • 18/05/2006
  • Data da publicação:
  • 04/01/2011
  • Prioridade unionista:
  • País Número Data
    ESTADOS UNIDOS ESTADOS UNIDOS 60/691,243 17/06/2005
Inventores:
  • Classificação:
  • C07K 14/18
    Pept?deos tendo mais de 20 amino?cidos; Gastrinas; Somatoestatinas; Melanotropinas; Derivados dos mesmos; / de v?rus; / V?rus de RNA; / Togaviridae, p. ex. flaviv?rus, v?rus da peste, v?rus da febre amarela, v?rus da hepatite C, v?rus da encefalite japonesa;
    ;
  • Início da fase nacional:
  • 17/12/2007
  • PCT:
  • Número: IB2006001313 Data:18/05/2006
  • WO:
  • Número: 2006/134433 Data: 21/12/2006

CEPA DO VÍRUS DA DENGUE-1 VIVO ATENUADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO POLIPROTEÍNA ISOLADA E FRAGMENTO DE POLIPROTEÍNA. A presente invenção refere-se às cepas de vírus VDV1 vivos atenuados (vírus da dengue sorotipo-1 derivado de células VERO) que foram obtidas a partir de cepas 16007 do vírus da dengue-1 tipo selvagem pela passagem em células PDK e sanitização em células VERO. A presente invenção refere-se também a composição de uma vacina que inclui uma cepa do VDV1.

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Documento



PI0613328-2


“CEPA DO VÍRUS DA DENGUE-1 VIVO ATENUADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, POLIPROTEÍNA ISOLADA E FRAGMENTO DE POLIPROTEÍNA”

Campo da Invenção

5    A presente invenção refere-se a novas cepas vivas de VDV1

atenuadas (vírus da dengue sorotipo-1 derivado de células VERO) que são obtidas a partir da dengue-1 tipo selvagem cepa 16007 pela passagem sobre células PDK e células Vero, e sanitização. A presente invenção refere-se também a uma composição de vacina que compreende tais cepas VDV1.

10    Antecedentes da Invenção

A dengue é causada por quatro tipos sorológicos virais estreitamente relacionados, mas antigenicamente distintos, (Gubler, 1988; Kautner et al., 1997; Rigau-Pérez et a/., 1998; Vaughn et ai, 1997), do gênero Flavivirus (Gubler, 1988). A infecção por um sorotipo do vírus da dengue pode 15 produzir um espectro de doenças clínicas que podem variar de uma síndrome viral não específica á uma severa, doença hemorrágica fatal. O período de incubação da febre da dengue (DF), após as picadas de mosquitos dura em média 4 dias (variação de 3-14 dias). DF caracteriza-se por febre bifásica, dor de cabeça, dores em várias partes do corpo, prostração, erupção cutânea, 20 linfodenopatia e leucopenia (Kautner et ai, 1997; Rigau-Pérez et ai, 1998). O período virulento é o mesmo que o da doença febril (Vaughn et ai, 1997). A recuperação da DF é geralmente concluída em 7 a 10 dias, mas a astenia prolongada é comum. A diminuição na contagem de leucócitos e plaquetas são freqüentes.

25    A dengue hemorrágica (FHD) é uma doença febril grave

caracterizada por anormalidades da homeostase e aumento da permeabilidade vascular que pode levar a hipovolemia e hipotensão (Síndrome de choque por dengue, DSS) muitas vezes complicada por grave hemorragia interna. A taxa

de mortalidade do caso FHD pode ser tão alta quanto 10%, sem tratamento, mas inferior a 1% na maioria dos centros com experiência terapêutica (WHO Technical Guide, 1986).

O diagnóstico laboratorial de rotina das infecções por dengue é 5 baseado no isolamento do vírus e/ou na detecção de anticorpos específicos do vírus da dengue.

A doença da dengue é a segunda doença infecciosa tropical mais importante após malária, com mais da metade da população mundial (2,5 bilhões) vivendo nas áreas de risco de epidemia. Há uma estimativa de que 50 10 a 100 milhões de casos de dengue, 500.000 pacientes hospitalizados com FHD e 25.000 mortes por dengue ocorrem todos os anos. A dengue é endêmica na Ásia, no Pacífico, África, América Latina e Caribe. Mais de 100 países tropicais têm endemias de infecções virais de dengue, e FHD têm sido documentados em mais de 60 destes países (Gubler, 2002; Monath, 1994). Um número de 15 fatores bem descritos parecem estar envolvidos nas infecções por dengue: crescimento populacional, urbanização descontrolada e não planejada e particularmente associado com a pobreza, aumento do tráfego aéreo, a falta de controle efetivo dos mosquitos, bem como a deterioração das infra-estruturas sanitárias e de saúde pública (Gubler, 2002 ). A conscientização da dengue 20 pelos viajantes e estrangeiros está aumentando (Shirtcliffe et ai, 1998). A dengue provou ser uma das principais causas de doença febril nas tropas norte-americanas durante o posicionamento estratégico em áreas tropicais onde a dengue é endêmica (DeFraites etal., 1994).

Os vírus são mantidos em um ciclo que envolve os humanos e o 25 Aedes aegypti, um mosquito doméstico, que pica durante o dia e que prefere se alimentar nos seres humanos. A infecção no humano é iniciada através da injeção do vírus durante a alimentação de sangue por um mosquito Aedes aegypti infectado. O vírus na saliva é depositado principalmente nos tecidos

extravasculares. O principal tipo celular infectado após inoculação são as células dendríticas, que posteriormente migram para drenagem dos gânglios linicticos (linfonodos) (Wu et ai, 2000). Após a replicação inicial na pele e a drenagem para os gânglios linfáticos, o vírus aparece no sangue durante a fase 5 aguda febril, geralmente por 3 a 5 dias.

Monócitos e macrófagos estão juntamente com as células dendríticas entre os alvos principais do vírus da dengue. A proteção contra a reinfecção homotípica é completa e provavelmente para a vida toda, mas a proteção cruzada entre os tipos de dengue dura menos de 12 semanas (Sabin, 10    1952). Conseqüentemente, um paciente pode experimentar uma segunda

infecção com um sorotipo diferente. Uma segunda infecção por dengue é teoricamente um fator de risco para desenvolver uma doença severa. No entanto, a FHD é multifatorial, incluindo: a cepa do vírus envolvido, bem como a idade, o estado imune e predisposição genética do paciente. Dois fatores têm 15 um papel importante na ocorrência da FHD: uma rápida replicação viral com alta viremia (a gravidade da doença está relacionada com o nível de viremia (Vaughn et ai., 2000) e uma importante resposta inflamatória com liberação de altos níveis de mediadores inflamatórios (Rothman e Ennis, 1999).

Não existe um tratamento específico contra a dengue. O 20 tratamento da DF se baseia no repouso na cama, controle da febre e dores com o uso de analgésicos e antipiréticos, e adequada ingestão de fluidos. O tratamento da FHD necessita da correção da perda de fluidos, substituição dos fatores de coagulação, e infusão de heparina.

As medidas preventivas contam atualmente com o controle do 25 vetor e medidas de proteção pessoal, que são medidas caras e difíceis de se aplicar. Nenhuma vacina contra a dengue está atualmente registrada. Desde os 4 sorotipos de dengue que estão em circulação no mundo e uma vez que são relatados por estarem envolvidos nos casos de FHD, a vacinação deverá

idealmente conferir proteção contra todos os 4 sorotipos do vírus da dengue.

Vacinas vivas atenuadas (LAVs), que reproduzem a imunidade natural, foram utilizadas para o desenvolvimento de vacinas contra muitas doenças, incluindo alguns vírus pertencentes ao mesmo gênero da dengue 5 (exemplos de vacinas de flavivírus vivos atenuados comercialmente disponíveis incluem vacinas da febre amarela e da encefalite japonesa). As vantagens de vacinas de vírus vivos atenuados estão na sua capacidade de replicação e indução tanto de respostas humorais quanto de respostas imune-celulares. Além disso, a resposta imune induzida por um conjunto de Vírion da vacina 10 contra os diferentes componentes do vírus (proteínas estruturais e não estruturais) reproduz as respostas induzidas pelas infecções naturais.

O projeto vacina da dengue foi iniciado na Tailândia, no Centro de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto de Ciências e Tecnologia para o Desenvolvimento Mahidol University. Vacinas candidatas com vírus vivos 15 atenuados foram desenvolvidos com êxito, a uma escala laboratorial, para o vírus da dengue sorotipo-1 (cepa 16007, passagem 13 = LAV1), sorotipo-2 (cepa 16681, passagem 53), e sorotipo-4 (cepa 1036, passagem 48) em células primárias de rim de cachorro (PDK), e para o sorotipo-3 (cepa 16562), em células primárias de rim de macaco verde (PGMK) (passagem 30) e células 20 fetais de pulmão de macaco Rhesus (FRhL) (passagem 3). Essas vacinas foram testadas como vacinas monovalente (sorotipo único), bivalente (dois sorotipos), trivalente (três sorotipos) e tetravalente (todos os quatro sorotipos) em voluntários tailandeses. Essas vacinas demonstraram ser seguras e imunogênicas em crianças e adultos (Gubler, 1997). Estas cepas de LAV 1-4 25 foram descritas na patente EP 1.159.968, em nome de Mahidol University e foram depositados perante a CNCM (CNCM I-2480; CNCM 1-2481; CNCM I-2482 e CNCM I-2483, respectivamente).

A seqüência completa da cepa do vírus da dengue-1 vivo

atenuado (LAV1), que foi criada por R. Kinney et al. (CDC, Fort Collins). Diferenças na seqüência entre as cepas de origem DEN-1 cepa 16007 (SEQ ID N° % e cepa LAV1 (SEQ ID N° 3) estão descritas na Tabela 1. Assim, a comparação genética do vírus tipo selvagem cepa 16007 e da cepa LAV-1 5 demonstrou um conjunto de 14 mutações pontuais que podem estar ligados à atenuação da LAV1.

Tabela 1: Diferenças Na Seqüência DEN-1 16007 E DEN-1 16007/PDK13

(LAV1)

Coordenadas

LAV1 (DEN-1 16007/PDK13)

16007

Gene-aa

Posição

Nt

aa

nt

aa

E-130

Nt-1323

C

Ala

T

Vai

Nt-1541

A

G

E-203

Nt-1543

G

Lys

A

Glu

E-204

Nt-1545

A

Lys

G

Arg

E-211

Nt-1567

G

Gin

A

Gin

E-225

Nt-1608

T

Leu

C

Ser

E-477

Nt-2363

G

Vai

A

Met

NS1-92

Nt-2695

C

Asp

T

Asp

NS1-121

Nt-2782

T

Ala

C

Ala

NS3-182

Nt-5063

A

Lys

G

Glu

NS3-510

Nt-6048

T

Phe

A

Tyr

NS4A-144

Nt-6806

G

Vai

A

Met

NS4B-168

Nt-7330

G

Gin

A

Gin

NS5-624

Nt-9445

T

Ser

C

Ser

Alterações de nucleotídeos que modificam o códon 10 correspondente são indicadas em negrito.

A cepa LAV1, que foi inicialmente estabelecida em 1983 foi rapidamente identificada como candidata à vacina em potencial

(Bhamarapravati e Yoksan, 1997).

Entretanto, nesse momento, a transmissão ao homem da encéfalite espongiforme através de culturas de mamíferos não foi encarado como um risco e rotineiramente o vírus foi mantido em células primárias de rim de cachorro (PDK). Além disso, esta cepa LAV1 corresponde a uma população heterogênea. Esta heterogeneidade representa um risco adicional devido a uma potencial seleção in vitro ou in vivo de uma das cepas presentes na composição.

Descrição Resumida da Invenção

Em face destas preocupações crescentes, o depositante decidiu criar um processo de sanitização, a fim de se livrar de tais riscos. Primeiro transferindo a vacina com LAV1 das células PDK para células VERO e, em seguida, transfectando células Vero com RNA genômico purificado de LAV1, seguida por duas etapas sucessivas de purificação da placa de vírus, o depositante elaborou um novo vírus sorotipo-1 derivado de Vero (VDV1).

Esta nova cepa VDV1, a qual tem sido, portanto, derivada pela transferência para células VERO e clonagem biológica, difere da cepa LAV1 pela sequência, homogeneidade de tamanho na placa e sensibilidade a temperatura, mas, sobretudo conserva algumas características fenotípicas e genotípicas do LAV1, como por exemplo, pontos de atenuação, fenótipo de pequenas placas, restrição de crescimento a alta temperatura, e foram conservadas as características imunogênicas das cepas LAV1. Estas características tornam esta nova cepa uma valiosa vacina candidata à vacinação profilática em seres humanos.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

'Vírus da dengue" são vírus de senso positivo, de RNA de fita simples pertencente ao gênero Flavivirus da família flaviridae. No caso da

dengue, sorotipo-1 (DEN-1) cepa 16007, a seqüência completa tem o comprimento de 10735 nucleotídeos (SEQ ID N° 2). O genoma RNA contém um *Cap tipo-l no final 5'-, mas necessita de uma cauda poli(A) na extremidade 3'-. A organização dos genes é 5'- região não codificadora (NCR), proteínas 5 estruturais ((C), pré-membrana / membrana (prM/M), envelope (E)) e proteínas não estruturais (NS1-NS2A - NS2B - NS3 - NS4A - NS4B - NS5) e 3 'NCR. O genoma RNA viral está associada à proteína C para formar o núcleocápside (de simetria icosaedral). Tal como acontece com outros flavivirus, o genoma DEN viral codifica uma fase de leitura aberta (ORF) ininterrupta, que é 10 traduzido para uma única poliproteína.

Passagens seriais de cepas virulentas (causadoras de doença) de dengue-1 resultam no isolamento do vírus modificado que são "vivos atenuados", ou seja, infecciosos, ainda não capazes de causar doença. Estes vírus modificados são geralmente testados em macacos para avaliar a sua 15 atenuação. No entanto, seres humanos são os únicos primatas que apresentam sinais clínicos da doença. Os vírus que causam de moderado (ou seja, aceitável em termos de fins regulatórios como apresentam uma relação risco/benefício positiva), a baixo ou nenhum efeito secundário (ou seja, manifestações sistêmicas e/ou anormalidades biológicas e/ou reações locais) 20 na maioria dos seres humanos testados, mas que continuam a infectar e induzir uma resposta imunológica, são chamados de "vivo atenuado".

O termo "LAV" denota cepas virais vivas atenuadas da dengue. No contexto da presente invenção "LAVs" são cepas de vírus vivos atenuados inicialmente derivados do vírus da dengue sorotipo-1 (DEN-1) cepa 16007 por 25 passagens, por exemplo, 10, 11, 12 ou 13 passagens, em células primárias de rim de cachorro (PDK). Por exemplo, "LAV1/PDK13" é a cepa atenuada estabelecida após 13 passagens da cepa 16007 em células PDK (também chamado DEN-1 16007/PDK13). A seqüência de nucleotídeos LAV1/PDK13 é

mostracla na SEQ ID N°3.

"VDV1" quer dizer uma LAV obtida pelo processo de sanitização divulgado no presente pedido. Uma VDV1 é, assim, um clone biológico (homogêneo) do vírus da dengue sorotipo-1 adaptado em células VERO capaz de induzir uma resposta imune humoral incluindo neutralização de anticorpos em primatas especialmente no ser humano. As cepas de VDV1 da presente invenção podem ser facilmente reconstruídas iniciando diretamente a partir das seqüências de VDV1 aqui divulgadas. A indução de uma resposta imune humoral pode ser facilmente determinada por um teste de ELISA. A presença de anticorpos neutralizantes no soro de uma vacina é avaliada pelos testes de neutralização por redução de placa, conforme descrito na seção 4.1.2.2. Um soro é considerado como positivo para a presença de anticorpos neutralizantes quando o grau de anticorpo neutralizante assim determinado é, pelo menos, superior ou igual a 1:10.

O termo "mutação" significa quaisquer mudanças detectáveis de material genético, por exemplo, DNA, RNA, cDNA, ou a qualquer processo, mecanismo, ou resultado de tal mudança. Mutações incluem substituições de um ou mais nucleotídeos. No contexto do atual pedido, mutações identificadas na seqüência genômica ou poliprotéica do vírus da dengue-1 são designados ao abrigo da nomenclatura de Dunnen e Antonarakis (2000). Conforme definido por Dunnen e Antonarakis no nível de ácidos nucléicos, substituições são designadas por ">", por exemplo, "31 A>G" denota que uma A é alterada para uma G no nucleotídeo 31 da seqüência de referência.

As variações no nível da proteína descrevem a conseqüência da mutação e são apresentados como se segue. Códons de parada são designados por X (ex: R97X denota uma mudança de Arg96 a um códon de terminação). Substituições de aminoácido são designados por "S9G", o que significa que uma Ser na posição 9 é substituída pela Gly.

Vírus da Dengue Sorotipo-1 Derivadas de VERO (VDV1)

A composição da vacina candidata LAV1 da dengue-1 anteriormente desenvolvida foi aperfeiçoada por um processo de sanitização.

O vírus da dengue sorotipo-1 derivadas de vero (VDV1) divulgada no presente pedido utiliza o vírus atenuado DEN-1 16007 por passagens em série por células PDK. O VDV1 contém toda a seqüência genômica dos vírus vivos atenuados DEN-1, e produzem os mesmos sítios que foram ligados a atenuação como a cepa original LAV1, que foram testadas em seres humanos.

A sanitização da vacina candidata LAV1 foi feita através da remoção de proteínas e introduzindo apenas o material viral genômico purificado nas células Vero. Mais especificamente, a sanitização da cepa foi realizada em 2 etapas: