Usos de uma composição contendo um biofármaco expressando a proteína de choque térmico hsp65 de micobactérias

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0705784-9 A2
  • Data do depósito:
  • 17/08/2007
  • Data da publicação:
  • 14/04/2009
Inventores:
  • Classificação:
  • A61K 48/00
    Prepara??es medicinais contendo material gen?tico o qual ? inserido nas c?lulas dos corpos vivos para tratar doen?as gen?ticas; Geneterapia;
    ;
    A61P 43/00
    F?rmacos para fins espec?ficos, n?o previstos nos grupos ;
    ;
    C12N 15/63
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Introdu??o de material gen?tico ex?geno usando vetores; Vetores; Utiliza??o de hospedeiros para os mesmos; Regula??o da express?o;
    ;
    C12N 15/31
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas microbianas, p. ex. enterotoxinas;
    ;
    A61K 31/711
    Prepara??es medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos; / Carboidratos; A??cares; Derivados dos mesmos; / Compostos tendo tr?s ou mais nucleos?dios ou nucleot?dios; / ?cidos desoxiribonucleicos naturais, i.e. contendo apenas 2'-desoxiriboses ligadas ? adenina, guanina, citosina ou timina e tendo liga??es 3'-5'-fosfodi?steres;
    ;
    C12N 15/03
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, prepara??o ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Prepara??o de c?lulas h?bridas por fus?o de duas ou mais c?lulas, p. ex. fus?o de protoplastos; / Bact?rias;
    ;

USOS DE UMA COMPOSIÇÃO CONTENDO UM BIOFÁRMACO EXPRESSANDO A PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO HSP65 DE MICOBACTÉRIAS. A presente invenção trata do uso de uma composição de DNA contendo o gene da proteina de choque térmico (heat shock protein - HSP) de 65 KDa de micobactérias no preparo de um biofármaco para prevenção, tratamento e/ou cura de doenças inflamatórias, infecciosas e/ou fibróticas em seres humanos e animais. Particularmente, o presente pedido destina-se ao emprego do biofármaco na terapia da doença intersticial pulmonar (DIP).

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Documento

PI0705784-9

“USOS DE UMA COMPOSIÇÃO CONTENDO UM BIOFÁRMACO EXPRESSANDO A PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO HSP65 DE MICOBACTÉRIAS”

Campo pa Invenção

5    A presente invenção trata do uso de uma composição de

DNA contendo o gene da proteína de choque térmico (heat shock protein - HSP) de 65 KDa de micobactérias no preparo de um biofármaco para prevenção, tratamento e/ou cura de doenças inflamatórias, infecciosas e/ou fibróticas em seres humanos e animais. Particularmente, o 10 presente pedido destina-se ao emprego do biofármaco na terapia da doença intersticial pulmonar (DIP).

Antecedentes da Invenção

Mundialmente, aproximadamente 5 milhões de pessoas estão afetados pela fibrose pulmonar. A epidemiologia para a fibrose 15 pulmonar idiopática (FPI) é escassa e os números apresentados são variáveis. Existem dados mostrando incidência desde 7,4 e 10,7 casos/100.000 habitantes/ano entre mulheres e homens, atingindo até 67,2 e 80,9 respectivamente (Ciystal, R.G. et al. Future research directions in idiopathic pulmonaiy fibrosis: summaiy of a national 20 heart, lung, and blood institute working group. American Journal of Respiratory and Criticai Care Medicine, 166:236-46. 2002; Coultas, D.B. et al. The epidemiology of interstitial lung diseases. American Journal of Respiratory and Criticai Care Medicine, 150:967-972. 1994).

As publicações da “American Thoracic Society” relatam 25 aspectos e características da FPI, assim como a forma de diagnóstico e tratamento (American Thoracic Society. Idiopathic Pulmonaiy Fibrosis: Diagnosis and Treatment. International Consensus Statement.

American Journal of Respiratory and Criticai Care Medicine, 161:646-664, 2000. American Thoracic Society/European Respiratory Society. International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Intersticial Pneumonias. American Journal of Respiratory and 5 Criticai Care Medicine, 165:277-304,2002).

A média de sobrevida a partir do diagnóstico é de 3 a 5 anos ou 28 meses após o início dos sintomas e a mortalidade atinge 50-70% até 5 anos após o diagnóstico (American Thoracic Society. Idiopathic pulmonaiy fíbrosis: diagnosis and treatment. International consensus 10 statement. American Journal of Respiratory and Criticai Care Medicine, 161:646-664. 2000).

A fibrose é um processo patológico progressivo e crônico que envolve uma expansão gradual da massa fibrótica levando a destruição dos tecidos e órgãos envolvidos. Ocorre permanente perda da 15 função tecidual, incluindo o transporte de oxigênio. A patogênese das desordens é similar em relação aos tecidos envolvidos. Fisiologicamente, há um balanço entre a formação e degradação da matriz. Este balanço diminui em casos de fibrose. O mecanismo molecular da fibrose não está totalmente esclarecido. Estudos têm mostrado que a proliferação 20 das células produtoras da matriz com subsequente super produção e acúmulo de proteínas na matriz contribuem para várias doenças fibróticas humanas e experimentais.

A resposta inflamatória associada ao desenvolvimento da FPI compreende 4 fases: de reconhecimento, de recrutamento, de 25 remoção e de reparação. Esses fenômenos, embora tendam a acontecer de maneira seqüencial, podem ocorrer simultaneamente (Anthoniou, K.M et al. Pathogenetic pathways and novel pharmacotherapeutic

targets in idiopathic pulmonary fibrosis. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics, In Press. 2006).

Na fase de reconhecimento admite-se que ocorra a produção de citocinas de resposta aguda como, por exemplo, a IL-1 e o 5 TNF-a, e um aumento da expressão de moléculas de adesão para leucócitos circulantes. Em seguida, a fase de recrutamento caracterizada por aumento da população celular nos espaços aéreos distais, com o acúmulo de neutrófilos, linfócitos, células dendríticas e células “natural killers", mediadas pela ação de citocinas. 10 Consequentemente, durante a fase de remoção linfócitos T helper (Th) expressam citocinas com padrão de resposta Thl e Th2. As citocinas do tipo Thl, como a IL-2 e o interferon-y (IFN-y) estimulam respostas de natureza celular e a remoção de antígenos diminuindo a proliferação de fibroblastos e a angiogênese. Citocinas do tipo Th2, como a IL-4, IL-5, 15    IL-10 e IL-13, promovem resposta humoral conduzindo a ativação de

fibroblastos e fibrose. Por fim, em meio à fase de reparação a presença de um desequilíbrio entre as respostas imunológicas de padrão Thl e Th2, com predomínio Th2 e aumento dos níveis de TGF-p, leva a angiogênese desregulada, produção e deposição de matriz extracelular e 20 colágeno.

Entre inúmeros mediadores relacionados com o desenvolvimento da fibrose pulmonar, o TGF-P é reconhecido como um dos mais importantes, devido às suas propriedades de intensa ativação para o crescimento mesenquimal e habilidade de modular respostas 25 imunes celulares. O TGF-p inibe a liberação e a supressão de reações imunes dependentes de IFN-y. A superexpressão do TGF-P em modelos animais leva a fibrose pulmonar e níveis elevados desse mediador

podem ser detectados em modelos animais de fibrose e nos tecidos de pacientes com FPI (Keane, M.P. et al. Inflammation and angiogenesis in fibrotic lung disease. Seminars in Respiratory and Criticai Care Medicine, 27:589-99. 2006).

5    Citocinas do tipo Thl parecem estar envolvidas na resposta

imune celular associada com doenças autoimunes e rejeição de enxertos, enquanto as citocinas do tipo Th2 estariam envolvidas predominantemente com reações alérgicas e doenças fibroproliferativas crônicas como a asma, dermatite atópica, FPI e esclerose sistêmica.

10    Estudos em tecido pulmonar de pacientes com FPI

demonstraram a presença tanto de citocinas do tipo Thl como Th2. Entretanto, foi observado que citocinas Th2 (IL-4 e IL-5) predominam em relação as Thl (IFN-y). Além disso, os níveis de IFN-y correlacionam-se de modo inverso com os níveis de pro-colágeno tipo III no lavado 15 broncoalveolar desses pacientes. Os níveis de IFN-y no lavado broncoalveolar também se correlacionaram inversamente com a progressão da fibrose pulmonar (Gross, T.J. e Hunninghake, G.W. Idiopathic pulmonary fibrosis. New England Journal of Medicine, 345:517-525. 2001).

20    Adicionalmente, estudos em animais demonstraram que o

IFN-y (1) suprime de forma intensa a deposição de proteínas da matriz extracelular como colágeno e fibronectina; (2) inibe a produção in vitro de colágeno pelos fibroblastos e condrócitos; (3) reduz o crescimento de fibroblastos pulmonares induzidos pelo fator de crescimento plaquetário 25 PDGF; (4) aumenta a expressão de genes de metaloproteinases envolvidas com a degradação da matriz extracelular; e (5) reduz a deposição da matriz extracelular em modelos animais de fibrose

(Gurujeyalakshmi, G. e Giri, S.M. Molecular mechanisms of antifibrotic effect of interferon gamma in bleomycin-mouse model of lung fibrosis: down regulation of TGF-beta and procollagen I and III gene expression. Experimental Lung Research, 21:791-808. 1995).

5    O tratamento para FPI é efetuado com corticosteróides,

agentes imunossupressores, agentes antioxidantes e antifibróticos (Nathan, S.D. Therapeutic management of idiopathic pulmonaiy fibrosis: an evidence-based approach. Clinics in Chest Medicine, 27:27-35, 2005).

10    Os corticosteróides são administrados para o controle do

processo inflamatório. Entretanto não há melhora significante na taxa de sobrevida com esses tratamentos e observa-se alta incidência de efeitos colaterais relacionados aos medicamentos usados na terapia.

Pacientes com FPI não responsíveis ao tratamento com 15 corticosteróides e agentes imunossupressores foram tratados com IFN-y e prednisolona e apresentaram melhora da capacidade pulmonar total e da oxigenação em repouso, enquanto que nos indivíduos tratados apenas com prednisolona oral ocorreu deterioração funcional respiratória (Ziesche, R. et al. A preliminaiy study of long-term 20 treatment with interferon Gamma-lb and low-dose prednisolone in patients with idiopathic pulmonaiy fibrosis. New England Journal of Medicine, 341:1264-1269. 1999).

O estudo de Raghu, (Raghu G. A placebo controlled trial of interferon gamma-lb in patients with idiopathic pulmonaiy fibrosis. 25 New England Journal of Medicine, 350:125-133. 2004) avaliou a segurança e eficácia do tratamento da FPI com IFN-y em pacientes com FPI, sem prévio tratamento. Os pacientes foram medicados com

prednisona em baixas doses e IFN-y 1-p ao longo de 48 semanas. A porcentagem dos pacientes que foram a óbito ou apresentaram deterioração funcional não diferiu significantemente entre os grupos (IFN-y = 46,3% X placebo = 51,8%). Uma análise secundária dos dados 5 de mortalidade estratificados pelo grau de comprometimento da função pulmonar no momento de entrada no estudo evidenciou que o tratamento com IFN-y nos indivíduos com capacidade vital forçada superior a 62% do previsto, cursou com uma mortalidade significantemente inferior a do grupo placebo (IFN-y = 4% X placebo = 10 12%).

A publicação de Bajwa, (Bajwa E.K. et al. Interferon-y 1 P therapy in idiopathic pulmonaiy fibrosis: a metaanalysis. Chest, 128:203-206. 2005) comparou a taxa de mortalidade entre pacientes com FPI tratados com IFN-y e àqueles que receberam tratamentos 15 convencionais. O estudo mostrou uma redução na mortalidade no grupo que recebeu IFN-y (0,253 X 0,690; p = 0,0003). A comparação da mortalidade em diferentes tempos, também mostra redução na mortalidade no grupo tratado com IFN-y (12 meses: 0,0244 X 0,1478; p = 0,0063; 18 meses: 0,1065 X 0,2299; p < 0,0001; 21,7 meses: 0,1386 20 X 0,2492; p < 0,0001 e 24 meses: 0,1652 X 0,3652; p < 0,0001). Estes resultados sugerem que o uso de IFN-y pode trazer benefícios para os casos em fase inicial da doença.

Nas últimas décadas, surgiram consideráveis evidências de que a ativação e proliferação de fibroblastos e deposição de colágeno 25 durante a manutenção de processos fibróticos crônicos pulmonares seja mediado por ação de citocinas teciduais. Estão implicados nesse processo o TGF-p, TNF-a, PDGF, IGF-1, ET-1, IL-1 e IL-8. Estudos in

vitro revelam que o TGF-p tem um importante papel estimulador de deposição de matriz extracelular. O TGF-p 1 promove expressão de genes pró-colágeno e síntese protéica. As isoformas TGF-2 e TGF-3 também estão envolvidas na formação de colágeno em humanos. Em 5 contrapartida, muitos estudos sugerem o papel antifibrótico do IFN-y, como a inibição de fibroblastos e da síntese de colágeno in vitro e a atenuação da fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Esses estudos motivaram a aplicação do IFN-y em humanos para tratamento de FPI, mas os resultados foram pouco expressivos (Agostini, C. e Gurrieri, C. 10 Chemokine/ Cytokine cocktail in idiopathic pulmonary fibrosis. Proceedings of the American Thoracic Society, 3:357-363. 2006; Raghu, G. A placebo controlled trial of interferon gamma-lb in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. New England Journal of Medicine, 350:125-133. 2004).

15    A fisiopatologia da FPI não é totalmente compreendida.

Consequentemente, o prognóstico dos pacientes é deficiente e os medicamentos disponíveis são insatisfatórios. O transplante pulmonar deve ser considerado para pacientes com a doença em estágio avançado e que não apresentam resposta aos tratamentos disponíveis. A 20 necessidade de novas opções terapêuticas para FPI, inclusive o uso de imunomoduladores, é um consenso entre os pneumologistas.

Dentre os principais imunomoduladores com possíveis aplicações na clínica humana e animal as proteínas de choque térmico (HSPs) se destacam. As HSPs são moléculas intracelulares produzidas 25 por eucariotos e procariotos e que funcionam como chaperonas moleculares em muitos processos bioquímicos, como enovelamento de proteínas e transporte, trafego de peptídeos, e processamento de

antígeno sob condições fisiológicas e de estresse (Manjili, M.H. et al., Câncer immunotherapy and heat-shock proteins:    promises and

challenges. Expert Opinion on Biological Therapy, 4:363-373. 2004). As HSPs são proteínas de vários pesos moleculares, tais como, e as 5 principais HSP20, HSP60, HSP65-68, HSP70, HSP90, HSP110 KDa, e outras. Algumas dessas HSPs são potentes imunomoduladores, indutoras de imunidade inata e de imunidade antígeno-específica. As HSPs ativam células dendríticas parcialmente através de receptores do tipo “tool-like”, ativam células natural “killer”, aumentam a 10 apresentação de antígenos a células efetoras e a resposta imune humoral e celular. Elas funcionam como “sinal de alerta” que prima por rotas de defesa no hospedeiro e essa função é explorada no desenvolvimento de vacinas para câncer e infecções (Todiyk, S.M. et al. Heat shock proteins refine the danger theoiy. Immunology, 99:334-337. 15    2000).

Durante uma infecção, patógeno e hospedeiro aumentam significan temente suas sínteses de HSPs para se protegerem contra o estresse imposto pelo outro. Em analogia com respostas de célula B a auto-antígenos, é possível visar que células T reativas a HSP, como 20 células T especificamente reconhecendo HSP65, possam ser envolvidas de modo benéfico na resolução de inflamação por remoção de células estressadas.

A ativação de células dendríticas é necessária para o início da resposta imune primária e. secundária e pode ser induzida por 25 compostos como DNA, peptídeos, lipídeos ou açúcares, etc., presentes em patógenos ou por sinais endógenos prejudiciais liberados por tecidos sob estresse ou necrose. Exemplos de sinais endógenos prejudiciais

incluem HSPs, nucleotídeos, intermediários reativos de oxigênio, produtos de decomposição da matriz extracelular, neuromediadores e citocinas (como interferons) (Gallucci, S. e Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Current Opinion in Immunology, 13:114-5    119. 2001; Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family.

Annual Review of Immunology, 12:991-1045. 1994).

HSPs derivadas de patógenos podem facilitar a sobrevida do patógeno no hospedeiro e aumentar a virulência, mas algumas também atuam como imunoestimulantes no hospedeiro. HSP70 derivada de 10 Toxoplasma gondii induz maturação de células dendríticas e estimula a resposta de IL-12 (Kang, H.K. et al. Toxoplasma gondii-derived heat shock protein 70 stimulates the maturation of human monocyte-derived dendritic cells. Biochemical and Biophysical Research Communication, 322:899-904. 2004). HSP60 foi identificada como um ligante no fungo 15 Histoplasma capsulatum e media a ligação a receptores CD 18 em macrófagos humanos (Long, K.H. et al., Identification of heat shock protein 60 as the ligand on Histoplasma capsulatum that mediates binding to CD 18 receptors on human macrophages. Journal of Immunology, 170:487-494. 2003). A imunização de camundongos com 20 HSP60 recombinante de H. capsulatum conferiu proteção a um subseqüente desafio por esse fungo (Scheckelhoff, M. e Deepe, G.S., Jr. The protective immune response to heat shock protein 60 of Histoplasma capsulatum is mediated by a subset of V 8.1/8. 2+ T cells. Journal of Immunology, 169:5818-5826. 2002).

25    Para manter a homeostasia celular sob condições