Peptídeos cíclicos antiinflamatórios e antialérgicos

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0703175-0 A2
  • Número original:
  • PI 0602885-3 (Data:21/07/2006);
  • Data do depósito:
  • 04/07/2007
  • Data da publicação:
  • 14/04/2009
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 37/00
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios imunol?gicos ou al?rgicos;
    ;
    A61P 25/28
    F?rmacos para o tratamento de doen?as do sistema nervoso; / para tratamento de dist?rbios neurodegenerativos do sistema nervoso central, p. ex. agentes nootr?picos, intensificadores de cogni??o, f?rmacos para tratamento da doen?a de Alzheimer ou outras formas de dem?ncia;
    ;
    A61P 33/00
    Agentes antiparas?ticos;
    ;
    A61P 11/00
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios do sistema respirat?rio;
    ;
    A61K 38/12
    Prepara??es medicinais contendo pept?deos; / Pept?deos com at? 20 amino?cidos em uma sequ?ncia totalmente definida; Derivados destes; / Pept?deos c?clicos;
    ;
    C07K 1/16
    Processos gerais para preparação de pept?deos; / Extra??o; Separa??o; Purifica??o; / por cromatografia;
    ;
    C07K 1/06
    Processos gerais para preparação de pept?deos; / usando grupos protetores ou agentes de ativa??o;
    ;
    C07K 7/52
    Pept?deos tendo de 5 a 20 amino?cidos em uma sequ?ncia totalmente definida; Derivados dos mesmos; / Pept?deos c?clicos contendo pelo menos uma liga??o pept?dica anormal; / com apenas liga??es pept?dicas normais no anel;
    ;

PEPTÍDEOS CÍCLICOS ANTIINFLAMATÓRIOS E ANTIALERGICOS. A presente invenção refere-se a peptídeos cíclicos sintéticos compreendendo uma sequência de 13 L-aminoácidos em sua estrutura primária, que apresentam atividades antiinflamatórias e antialérgicas, úteis para o tratamento de inflamações e/ou alergias, agudas ou crônicas, sendo particularmente úteis para o tratamento da asma alérgica aguda ou crônica. A invenção também descreve uma composição farmacêutica contendo tais peptídeos, uso e método para tratar ou prevenir desordens inflamatórias e/ou alérgicas, agudas e/ou crônicas.

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Documento

20 Tabela 1

Seqüência identificadora

Ki (nM)

SeqOl

22,5

Seq02

24,0

Seq03

63,6

Seq04

42,0

Seq05

44,0

Seq06

24,2

Seq07

20, 0

Seq08

24,8

Seq09

21,8

EXEMPLO 2: Inibição da adesão e Rolamento de Leucócitos in vivo:

a) Rolamento de Leucócitos para os peptideos da presente invenção:

O ensaio para verificação da inibição da adesão e rolamento dos leucócitos foi realizado em camundongos (n = 3/por grupo), que foram anestesiados com pentobarbital sódico (Hypnol®, 50 mg/Kg) e mantidos sobre placa com temperatura controlada (37°C), em seguida sofreram manipulação cirúrgica na bolsa escrotal para exposição do músculo cremaster, que foi fixado ao redor de uma área transparente da placa. Esta foi posicionada sobre o charriot do microscópio óptico para possibilitar visualização in vivo da microcirculação local. As preparações foram mantidas úmidas e aquecidas por irrigação com PBS (phosphate buffered solution) (0,15 M) . O agente inflamatório LPS (lipopolissacarideo) , na concentração de 1 |ag/mL diluido em 20 p.L, foi aplicado topicamente no músculo cremaster. Foi registrado o aspecto da vênula pós-capilar antes e após a aplicação do LPS (lipopolissacarideo). Os peptideos SeqOl a Seq09 (1 pM) foram aplicados topicamente 15 min após a aplicação do LPS. Os eventos nas vênulas pré e pós-capilares, arteriolas e fibras musculares foram observados por até 30 minutos. Foram registrados e quantificados o rolamento dos leucócitos, a aderência firme e o extravasamento nas vênulas pós-capilares de 20-40 pm de diâmetro a cada 1 minuto durante 10 minutos. A transmigração foi definida como o número de leucócitos no tecido extravascular em um segmento de 100 pm. A microcirculação do cremaster foi analisada pela técnica da epi-iluminaçâo usando um microscópio intravital de fluorescência (Axio Imager Al, Carl Zeiss, Alemanha) como descrito por Sperandio et al (J. Exp. Med., 19; 197(10): 1355-1363, 2003).

Os peptideos testados induziram a diminuição do rolamento de leucócitos nas vênulas pós-capilares do cremaster de camundongos, na ordem de 50 a 90%, como se verifica na figura 2.

b) Rolamento de Leucócitos com peptideo modificado: Deleção dos aminoácidos das posições 1, 2 e 3

0 ensaio acima foi repetido com um peptideo modificado (Mod-3) no qual se promoveu a retirada dos aminoácidos das posições 1, 2 e 3 conforme representado abaixo:

SeqOl

Ile i -Pro2-Arg3-CyS4-Arg5-Ly S6-Met7-Pros-Gly9-V al i o-Lys 11 -Met 12-Cys 13

Mod(-3)

1 1

CyS4-Arg5-Lys6-Met7-Prog-Gly9-V al 1 o-Ly s 11 -Met 12-Cys 13

Esta modificação teve o intuito de verificar a essencialidade para a atividade    antiinflamatória    da

estrutura ciclica resultante da ponte dissulfeto entre os grupamentos tióis dos residuos de cisteinas das posições 4 e 13 dos aminoácidos da presente invenção. 0 peptideo do qual foram retirados os aminoácidos manteve atividade inibidora do rolamento de leucócitos em comparação com os peptideos descritos na presente invenção, como se verifica na figura 2.

c) Efeito da substituição da Lys na posição 11 na atividade dos peptideos da presente invenção

0 ensaio de rolamento de leucócitos foi repetido, segundo a descrição do exemplo 2, para um peptideo modificado (ModLys/Aia) no qual substituiu-se a lisina da posição 11 de um dos peptideos representantes da presente invenção por uma alanina (aminoácido com propriedades contrárias às da lisina) , a fim de se verificar a essencialidade da Lysn para a atividade dos peptideos da presente invenção, conforme representado abaixo:

SeqOl

1 1 ~ .....- "1

Ile 1 -Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Prog-Gly9-V al 1 o-Lysi 1 -Met 12-Cys 13

M0dLys/A|a

1 “ --1

Ile 1 -Pro2- Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Prog-Gly9-V al 1 o-Alai 1 -Met 12-Cys 13

0 peptideo modificado (ModLys/Aia) não se mostrou eficiente na inibição do rolamento de leucócitos, conforme demonstrado na figura 3, em comparação com o peptideo Seq07, mostrando a importância da presença da Lysn para a manutenção desta atividade farmacológica.

EXEMPLO 3: Prevenção da peritonite induzida pelo LPS

Camundongos foram injetados pela via intraperitoneal com 4 nmol ou 4 0 nmol do peptideo identificado por Seq07 dissolvidos em 500 |J.L de salina estéril, 30 minutos antes de realizar injeção intraperitoneal de LPS (055:BR 20 |ag/mL, Sigma) diluido em 500 (J.L de salina estéril. Animais injetados somente com salina estéril foram considerados como controle (Controle) .    24h após a injeção de LPS os animais

foram sacrificados com alta dose de hidrato de cloral para obtenção do lavado da cavidade peritoneal para contagem do número de células (A) , netrófilos (B) e macrófagos (C) .    0

material retirado foi centrifugado por 10 minutos a 1500 rpm a 4°C, o sobrenadante foi separado e congelado à -20°C para análises futuras e o material restante contendo as células, ressuspenso em PBS 0,1% BSA. A contagem total foi efetuada em câmara de Neubauer e para a contagem diferencial, uma aliquota da suspensão celular foi colocada em lâminas e submetida à centrifugação em centrifuga Citospin, coradas com Hema 3 e examinadas ao microscópio óptico, contando um total de 300 células. O número absoluto de cada população celular foi obtido pela multiplicação das porcentagens pelo número total de células encontradas no volume da amostra.

Ambas as concentrações do peptideo testado (4 nmol e 40 nmol) preveniram em cerca de 50% o recrutamento de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos injetados com LPS (comparando-se com o controle). Verifica-se, também, através da figura 4, que o peptideo preveniu o recrutamento de neutrófilos e macrófagos.

EXEMPLO 4: Inibição da Resposta Inflamatória Alérgica Pulmonar Aguda e Crônica

A indução da asma aguda pulmonar foi observada em animais BALB/c, machos com 7 semanas de idade que foram imunizados com ovalbumina (OVA) a 1% (grau V 10 f*g, Sigma) adsorvida em 1,6 mg de hidróxido de aluminio nos dias 0 e 7. A partir do 14° dia, os animais foram submetidos a 3 desafios por semana com OVA a 1% aerossol. Animais imunizados e somente desafiados com PBS (phosphate buffered solution) foram considerados controle (Controle). Para indução da asma crônica, os animais foram desafiados 3 vezes por semana durante 3 semanas consecutivas.

Para o desafio aerossol, os animais foram colocados em uma caixa plástica fechada, adaptada a um nebulizador ultra-sônico (US-800, ICEL) e expostos à inalação de 2 mL de solução de ovalbumina (grau V, Sigma) a 1% em salina durante 20 minutos. 24h após o último desafio aerossol, os animais foram sacrificados com alta dose de hidrato de cloral para obtenção do sangue periférico, do Lavado Bronco-Alveolar (BAL) e do tecido pulmonar para contagem do número total de leucócitos e contagem do número de eosinófilos.

Grupos de animais receberam tratamento com 4 nmol ou 40 nmol do peptideo identificado por Seq07 por via intranasal e por via intraperitoneal 30 minutos antes de cada desafio e por via oral 1 hora antes de cada desafio. O grupo de animais com asma crônica foi tratado somente com 4 nmol ou 40 nmol do peptideo identificado por Seq07 por via intraperitoneal 30 minutos antes de cada desafio.

Para a obtenção do BAL os animais de todos os grupos (OVA, tratados ou Controle) foram sacrificados com hidrato de cloral a 10%, exanquinados, e tiveram a traquéia canulada e o espaço aéreo lavado com 3 aliquotas de 1 mL de HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) + EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) . Após a coleta, o BAL foi imediatamente centrifugado a 800 rpm por 10 minutos, o sobrenadante desprezado e o botão celular re-suspenso em 1 mL de HBSS + 0,1% BSA (bovine serum albumin) para contagem das células. As células totais do BAL foram contadas na câmara de Neubauer e aliguotas contendo 5 x 105 células foram centrifugadas em lâminas de vidro usando uma citocentrifuga, por 5 minutos, a 600 rpm. Para determinar a porcentagem das diferentes populações celulares, as lâminas foram coradas com Hema 3 e a contagem de 300 células foi feita em campos aleatoriamente selecionados. Para obtenção do número absoluto de cada população celular no BAL, as porcentagens foram multiplicadas pelo número total de células encontradas no volume.

O tratamento dos animais apresentando asma aguda, com 4 nmol ou 40 nmol do peptideo testado em todas as vias de administração provocou uma diminuição no número total de leucócitos recrutados para o espaço alveolar, e esta diminuição foi caracterizada pela ausência de eosinófilos, como pode ser verificado na figura 5. O efeito do peptideo testado no recrutamento de células para o pulmão foi semelhante ao efeito induzido pela dexametasona na dose de 0,3 mg/Kg, por via oral.

O tratamento intraperitoneal dos animais apresentando asma crônica, com 4 nmol ou 40 nmol do peptideo testado, provocou uma diminuição no número total de leucócitos recrutados para o espaço alveolar, com diminuição de eosinófilos, como pode ser verificado na figura 6. O efeito do peptideo testado no recrutamento de células para o pulmão foi semelhante ao efeito induzido pela dexametasona na dose de 0,3 mg/Kg, por via oral.

Listagem de Seqüências

Seq.ID.n° 01:    (SeqOl)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 1

Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysn-IVIeti2-Cysi3

Seq.ID.n°02:    (Seq02)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 2

Vali-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Gluio-Lysii-Aspi2-Cysi3

Seq.ID.n°03:    (Seq03)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações adicionais:    Seqüência artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 3

Vali-GlU2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Alaio-Lysii-Aspi2-Cysi3

Seq.ID.n°04:    (Seq04)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 4

Vali-Gln2-Gln3-Cys4-Ser5-Glu6-Ile7-Ala8-Gly9-Alaio-Lysii-Proi2-Cysi3

Seq.ID.n°05:    (Seq05)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 5

Leu1-His2-Arg3-Cys4-Asp5-Lys6-Ile7-Ala8-Asp9-Alaxo-Lysix-Proi2-Cysi3

Seq.ID.n°06:    (Seq06)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações adicionais:    Seqüência artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 6

Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Ala6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-Cysi3

Seq.ID.n°07:    (Seq07)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 7

Il.ei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysu-Meti2-

Cysi3-NH2

Onde: NH2 é proteção amidica do grupamento carbóxi-terminal

Seq.ID.n°08:    (Seq08)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 8

Ac-Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-

Cys13

Onde: Ac é proteção com acetil no grupamento amino-terminal

Seq.ID.n°09:    (Seq09)

Comprimento: 13 Tipo: peptideo

Organismo: seqüência artificial

Informações    adicionais:    Seqüência    artificial:    peptideos

antiinflamatórios e antialérgicos.

Seqüência: 9

Ac-Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-

Cysi3_NH2

Onde: NH2 é proteção amidica no grupamento carbóxi-terminal e Ac é proteção com acetil no grupamento amino-terminal

REIVINDICAÇÕES

Peptídeos cíclicos sintéticos caracterizados por compreenderem    13    aminoácidos,    apresentando

especificamente o aminoácido cisteina nas posições 4 e 13 e o aminoácido lisina na posição 11 da cadeia peptidica e uma ponte de dissulfeto entre o grupo tiol do residuo de cisteina 4 e o grupo tiol do residuo de cisteina 13 possuindo atividade antiinflamatória e/ou antialérgica.

Peptideos de acordo com a reivindicação 1 caracterizados por compreenderem as seqüências consenso selecionadas do grupo que consiste de:

Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-]yiet7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-Cysi3 (Seq. ID. n°01)

Vali-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Gluio-Lysii-Aspi2-Cysi3 (Seq. ID. n° 02 )

Vali-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5-Ile6-Ile7-Gly8-Asp9-Alaio-Lysii-Aspi2-Cysi3 (Seq. ID. n°03)

Vali-Gln2-Gln3-Cys4-Ser5-Glu6-Ile7-Ala8-Gly9-Alaio-Lysii-Proi2-Cysi3 (Seq. ID. n°04 )

Leui-His2-Arg3-Cys4-Asp5-Lys6-Ile7-Ala8-Asp9-Alaio-Lysii-

Proi2-Cysi3 (Seq. ID. n°05)

Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Ala6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2--Cysi3 (Seq. ID. n°06)

Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-Cysi3-NH2 (Seq. ID. n°07)

Ac-Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysn-Meti2-Cysi3 (Seq. ID. n°08 )

Ac-Ilei-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Valio-Lysii-Meti2-Cysi3-NH2 (Seq. ID. n°09)

Peptideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que os aminoácidos são L-aminoácidos.