Método de tratamento de rejeito agroindustrial para destoxificação e redução da alergenicidade, com produção de lipases

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0703290-0 A2
  • Data do depósito:
  • 11/07/2007
  • Data da publicação:
  • 25/02/2009
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 9/14
    Enzimas, p. ex. ligases (6.); Pro-enzimas; Suas composições; Processos para preparar, ativar, inibir, separar, ou purificar enzimas; / Hidrolases (3.);
    ;
    C12R 1/80
    Micro-organismos; / Fungos; / Penicillium;
    ;
    C12S 3/10
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos; / Recupera??o ou purifica??o de material que cont?m carboidratos; / Tratamento do a??car ou mela?os;
    ;
    C12S 3/00
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos;
    ;
    C12S 3/14
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos; / Recupera??o ou purifica??o de mat?rias proteicas;
    ;

MÉTODO DE TRATAMENTO DE REJEITO AGROINDUSTRIAL PARA DESTOXIFICAÇÃO E REDUÇÃO DA ALERGENICIDADE, COM PRODUÇÃO DE LIPASES. E descrito um método de tratamento de rejeito de um processo agroindustrial, que inclui uma etapa de fermentação em meio sólido com um fungo filamentoso produtor de lipases seguida por uma etapa de extração para obtenção de um extrato enzimático e um resíduo sólido destoxificado e com alergenicidade reduzida em relação ao rejeito.

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MÉTODO DE TRATAMENTO DE REJEITO AGROINDUSTRIAL PARA DESTOXIFICAÇÃO E REDUÇÃO DA ALERGENICIDADE, COM

PRODUÇÃO DE LIPASES CAMPO DA INVENÇÃO

5    O método visa à obtenção de um extrato enzimático lipásico e um

resíduo tratado para descarte ou aproveitamento industrial. Mais especificamente, o método de tratamento combina a produção de lipases com a destoxificação e a redução da alergenicidade de um rejeito contendo ricina e albumina 2S, em especial de uma torta de mamona 10 proveniente de um processo de produção de biodiesel.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A eliminação e/ou inativação dos constituintes tóxicos e alergênicos são imprescindíveis para o manuseio e destino final de rejeitos de processos agroindustriais, sendo objeto de contínuo desenvolvimento 15 tecnológico.

Por exemplo, um rejeito agroindustrial, denominado de torta de mamona, é gerado em um processo para obtenção de biodiesel a partir de sementes de mamona, tal como ensina a patente US 7,112,229, onde sementes são trituradas e adicionadas diretamente a um reator químico 20 para uma reação de transesterificação com o etanol. Esta torta de mamona não pode ser utilizada nem como adubo por apresentar pH altamente alcalino, nem como alimento para animais por apresentar toxicidade e alergenicidade elevadas.

A mamona, uma semente da Ricinus communis L., é um vegetal 25 pertencente à família das Euphorbiaceae que compreende inúmeros tipos de plantas nativas da região tropical. Das sementes da mamona se extrai o óleo de rícino que contém 90% m/m de ácido ricinoleico (C17H32OHCOOH). Na cadeia de processos industriais de sementes de mamona, as tortas constituem rejeitos inadequados para descarte in 30 natura devido à presença de constituintes altamente tóxicos e alergênicos.

A ricina é o principal constituinte responsável pela toxicidade da mamona e está entre as proteínas de maior potencial tóxico para o homem. Trata-se de uma lecitina, ou seja, uma proteína 64kDa encontrada na semente de mamona (Ricinus communis). Tal holotoxina é constituída 5 por duas cadeias peptídicas de 32 e 34 kDa unidas por uma ligação dissulfídica S-S. A cadeia A (RTA) é uma ribotoxina que inibe a síntese de proteínas em células de animais mamíferos. Já a cadeia B (RTB) é uma lecitina que prende os resíduos de galactose na superfície das células. Uma simples molécula de RTA no citoplasma de uma célula inibe 10 completamente a síntese de proteínas. A dose letal de ricina estimada para humanos é da ordem de 10pg/kg.

Os alérgenos da mamona são conhecidos como um conjunto CB-1A. Tal conjunto é constituído por misturas complexas de proteínas e glicoproteínas de baixa massa molecular, ricas em arginina e ácido 15 glutâmico. Dentre os alérgenos do conjunto destaca-se a albumina 2S que

c

é uma proteína armazenada nas sementes de mamona. Estes alérgenos são proteínas estáveis, não-tóxicas que exibem capacidade extraordinária de sensibilizar indivíduos expostos a pequenas concentrações de partículas de sementes ou de resíduos agroindustriais de sementes de 20 mamona.

Visando reduzir os impactos ambientais causados pelo descarte de rejeitos industriais, estes podem ser aproveitados como matérias-primas de processos biotecnológicos, tal como ensina a WO 0233055A1 para a produção de preparado de enzimas hidrolíticas, de baixo custo, a partir do 25 tratamento de efluentes domésticos e industriais por um processo de fermentação que utiliza um fungo Penicillium restrictum

A patente US 5,093,256 também trata da produção de lipases a partir de um substrato de óleo de milho em meio de cultura puro de um bacilo específico. Neste caso o objetivo é obter uma lipase alcalofílica 30 essencialmente purificada.

Lipases são enzimas, do tipo glicerol éster hidrolases (E.C. 3.1.1.3) que apresentam grande versatilidade em aplicações industriais nas áreas de tecnologia de alimentos, ciências biomédicas, na indústria química, no tratamento de efluentes e no desenvolvimento de biosensores.

As lipases catalisam a hidrólise de ligações éster-carboxílicas presentes em tríacilgliceróis, liberando ácidos graxos e glicerol, e, em condições aquo-restritas, catalisam a síntese de ésteres.

No caso específico do setor energético, a utilização de enzimas lipásicas atende à premissa de aplicação de catalisadores de baixo custo para a síntese de combustíveis líquidos, em especial, na produção de biodiesel, tal como ensina a patente US 5,713,965.

A produção de biodiesel resulta de uma reação de transesterificação de um óleo ou gordura, produzindo ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos. Tal reação pode ser catalisada por um ácido ou por uma base, constituindo uma rota química de produção de biodiesel. Essa mesma reação, quando catalisada por enzimas, apresenta vantagens potenciais, tais como: a facilidade de separação do biocatalisador; a possibilidade de utilização de álcoois hidratados, como o etanol; a fácil recuperação do glicerol; e a conversão, em biodiesel, dos ácidos livres presentes no óleo vegetal.

Apesar de se encontrar bem estabelecida a rota química de produção de biodiesel a partir de óleos vegetais, a utilização de uma rota enzimática, mais especificamente a reação catalisada por lipases, se apresenta como uma excelente alternativa tanto para redução dos custos do processo de produção quanto para a redução dos impactos ambientais.

No entanto, para a viabilidade de processos industriais, empregando enzimas lipásicas em formulações de biocatalisadores, é preciso haver redução substancial dos custos de produção da enzima e um aumento na atividade e estabilidade da enzima nas formulações.

O método a seguir descrito visa satisfazer esses requisitos através

da utilização de substratos de baixíssimo custo em um processo de fermentação em meio sólido FMS que produz um extrato enzimático de lipases.

Desta forma, o presente método contribui para a redução dos 5 impactos ambientais causados por descarte de rejeitos agroindustriais, particularmente as tortas de mamona provenientes de um processo de obtenção de biodiesel a partir de sementes de mamona. E, de modo complementar, o método de tratamento possibilita obter biocatalisadores de baixo custo, úteis para a produção de biodiesel por via enzimática.

10 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De um modo amplo, a presente invenção trata de um método de tratamento de rejeitos agroindustriais, em especial de tortas de mamona, que combina a destoxificação e redução da alerginicidade com a produção de enzimas lipásicas.

15    O método utiliza rejeitos agroindustriais como substrato para

crescimento de microrganismos, por fermentação em meio sólido, com fungos filamentosos produtores de lipases. São obtidos: um extrato enzimático lipásico e um resíduo tratado para fins de descarte ou aproveitamento industrial.

20    Em alguns substratos, em especial com a torta de mamona

proveniente de um processo de obtenção de biodiesel por reação de transesterificação com o etanol a partir de sementes de mamona, o método contribui para a redução dos impactos ambientais provocados pelo descarte de tais rejeitos agroindustriais que apresentam constituintes

25 tóxicos e alergênicos.

Adicionalmente, o método de tratamento toma possível a produção de biocatalisadores de baixo custo, formulados com as enzimas do extrato enzimático lipásico produzido, imobilizadas em um suporte hidrofóbico.

Portanto, o crescimento de fungos filamentosos produtores de

30 lipases, para a destoxificação e redução da alerginicidade com a produção

de enzimas, agrega valor a rejeitos agroindustriais tóxicos e alergênicos que seriam indevidamente descartados para o meio ambiente. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O método de tratamento de rejeitos agroindustriais para destoxicação e redução da alergenicidade, descrito a seguir, também produz enzimas lipásicas a partir de rejeitos utilizados como substratos para crescimento de microrganismos por fermentação em meio sólido FMS.

Vários são os fungos produtores de lipases que apresentam resposta ao crescimento em substratos constituídos por rejeitos agroindustriais, em um processo de fermentação em meio sólido FMS.

O Exemplo 1 do presente relatório ilustra o processo de FMS de uma torta de babaçu, tal como ilustra a Tabela 1, onde foram utilizadas cepas de:    Penicillium restrictum, Penicillium simplicissimum,

Aspergillus parasiticus, Aspergillus sulphureus

Observa-se que o fungo Penicillium simplicissimum, em especial, apresenta excelente resposta ao crescimento no substrato e na produção de enzimas lipásicas, com comprovada atividade e produtividade.

Esta excelente resposta também se verifica quando um fungo filamentoso é inoculado em tortas de ma mona provenientes de um processo de produção de biodiesel descrito na patente US 7,112,229. Tal rejeito é considerado tóxico e alergênico e, como tal, não pode ser utilizado in natura, para adubo ou ração animal, o que representa um atrativo para a aplicação do método de tratamento por fermentação em meio sólido FMS utilizando um fungo filamentoso produtor de lipases.

Conforme se observa na Tabela 3, tortas de mamona, in natura ou autoclavada, possuem altas concentrações de toxina (ricina) e de uma fração de proteína alergênica (CB-1A ou albumina 2S isoforme). Tais constituintes restringem a utilização do rejeito do processamento de sementes de mamona.

Com base no Exemplo 3, observa-se que os procedimentos de redução do teor de ricina nem sempre reduzem a fração de proteína alergênica, sendo que ambos constituem parâmetros para avaliação da segurança no manuseio de uma torta com tais características, como as de um processo agroindustrial a partir de sementes de mamona.

Portanto, a eliminação total e/ou inativação de constituintes tóxicos e alergênicos é extremamente importante para a manipulação ou descarte de rejeitos agroindustriais.

A seguir, descreve-se detalhadamente a invenção que constitui um método de tratamento de rejeitos agroindustriais que combina a destoxificação e redução da alerginicidade com a produção de lipases, segundo as seguintes etapas:

a)    Prover um rejeito agroindustrial sólido, com partículas de diâmetro entre 0,21 mm e 1,18mm;

b)    Lavar o material sólido com água, ajustando o pH na faixa entre 5,0 e 7,0 unidades;

c)    Ajustar a umidade do material sólido na faixa entre 35% e 70% m/m, obtendo um substrato para fermentação em meio sólido;

d)    Conduzir a fermentação do substrato, em leito revolvido ou aerado, inoculado com um fungo filamentoso produtor de lipases na proporção entre 0,1 x 108e 1,0 x 108de esporos para cada 1g do material sólido, suplementado com fontes de carbono, sendo incubado em reatores sob temperatura na faixa entre 25°C e 35°C;

e)    Misturar o material sólido fermentado com uma solução tampão de fosfato de sódio na proporção de 5mL para cada 1g de material sólido e separar um extrato enzimátíco e um resíduo sólido;

f)    Recuperar o extrato enzimátíco com atividade lipásica e o resíduo sólido destoxificado e com alergenicidade reduzida em

relação ao rejeito agroindustrial.

Os fungos filamentosos produtores de lipases, aplicáveis ao método, podem ser selecionados entre: Penicillíum simplícissímum, Penicillium restrictum, Aspergillus parasiticus, Aspergillus sulphureus. Entretanto, o fungo Penicillium simplicissimum é considerado o mais adequado para a produção de enzimas lipásicas em um processo de fermentação em estado sólido FMS, conforme evidencia o Exemplo 1 utilizando como substrato uma torta de coco babaçu.

Para obter os esporos, uma cepa de um fungo filamentoso pode ser propagada à temperatura de 30°C durante 7 dias em um meio de cultura, contendo em um volume de 100 mL: amido solúvel 2,0g; MgS04 7H20 0.025g; KH2P04 0,05g; CaC03 0,5g; extrato de levedura 0,1g; óleo de oliva 1,0 ; e goma agar 1,0 ; os esporos sendo obtidos em suspensão em uma solução tampão de fosfato (100mM, pH 7).

A fermentação FMS deve ser realizada preferencialmente em reatores, contendo entre 10g e 20g de substrato em camadas de 1cm de espessura, preferencialmente em condições de temperatura entre 28°C e 30°C, e umidade entre 40% e 45% m/m obtida pela introdução de ar contendo 95% de saturação de água.

Para a fermentação FMS, o substrato pode ser proveniente de uma torta de um processo agroindustrial, ajustando o pH para valores entre 5,0 e 7,0, conforme evidencia o Exemplo 2.

O método se aplica, preferencialmente, ao tratamento de rejeitos agroindustriais que usualmente contêm ricina na faixa de concentração entre 0,1% e 2,0% m/m e albumina 2S entre 0,1% e 1,0% m/m. Como exemplo, o método se aplica ao tratamento de tortas de mamona provenientes de um processo de produção de biodiesel descrito na patente US7,112,229. Conforme evidenciam os exemplos a seguir, o método também pode ser aplicado ao tratamento outros rejeitos sólidos particulados provenientes de processos agroindustriais.

Em laboratório, o rejeito sólido pode ser triturado com um moinho de faca e peneirado com o auxílio de um agitador de peneiras para obter partículas com diâmetro especificado, preferencialmente entre 0,60mm e 0,85mm.

Após preparação que inclui a moagem e ajustes de pH e umidade, o substrato deve ser suplementado com fonte de carbono de baixo custo, tais como melaço, óleos vegetais e glicerina, na proporção entre 2% e 10% m/m para alcançar maiores rendimentos na fermentação FMS utilizando fungos filamentosos produtores de lipases.

Após a fermentação propriamente dita, o rejeito sólido deve resultar destoxificado, com eliminação de mais de 98% da toxina ricina, e com pelo menos 50% de redução da alerginicidade expressa como proteína albumina 2S.

Sendo assim, o rejeito agroindustrial sólido, após o método de tratamento para destoxificação e redução de alergenicidade, deve apresentar características que permitam descartar o material sólido sem agredir o meio ambiente, bem como a utilizá-lo na preparação de bioprodutos tais como ração animal.

Ainda vantajosamente, o extrato enzimático lipásico pode ser utilizado na produção de biocatalisadores, tendo sido obtido em meio de uma solução tampão de fosfato (100mM, pH 7,0) adicionada ao sólido fermentado na proporção de 5ml_/g, sob agitação e temperatura entre 30°C e 35°C, por um tempo superior a 20 min. Tal extrato, após um procedimento de separação sólido-líquido, que pode ser por prensagem seguida de centrifugação, deve apresentar atividade lipásica superior a 15 U/g de enzima por massa de substrato e atividade específica superior a 4 U/mg de enzima por massa de proteína produzida na fermentação, sendo a unidade de atividade lipásica definida como a quantidade de enzima que libera 1pmol de p-nitrofenol sob as condições de teste.

Desta forma, o extrato enzimático contendo lipases pode ser

misturado, em um suporte hidrofóbico do tipo polímero microporoso previamente embebido em etanol e lavado com água destilada. O extrato deve ser adicionado ao suporte e mantida a mistura em contato por tempo suficiente para imobilizar as enzimas no suporte, após o quê se realizam lavagens sucessivas para eliminação do solvente, conforme apresenta o Exemplo 4.

As enzimas lipásicas assim imobilizadas podem ser amplamente utilizadas como biocatalisadores em processos biotecnológicos, como por exemplo, em processos de produção de biodiesel e biolubrificantes por meio da reação de transesterificação e produção de ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos por via enzimática.

Segundo os procedimentos de laboratório apresentados a seguir, nos resíduos sólidos determinam-se os constituintes tóxicos e alergênicos e nos extratos líquidos determina-se a atividade lipásica.

Determinação da atividade lipásica

Atividade hidrolítica por método espectrofotométrico.

A atividade lipásica pode ser medida utilizando p-nitrofenil-laurato (pNP-laurato) como substrato. Determina-se pela adição de 0,05ml_ de enzima in natura em uma solução tampão contendo 2.2mL de 25mM fosfato (pH 7.0) e 0,25mL de 2.5mM pNP-laurato. A reação de hidrólise é conduzida na temperatura de 30°C e medida ao longo do tempo, por espectrofotometria em comprimento de onda de 412 nm. Uma unidade de atividade lipásica é definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol de p-nitrofenol sob as condições de teste.

A atividade enzimática é então expressa em (U/g) unidades por massa de torta e a atividade específica em (U/mg) unidades por massa de proteínas produzidas.

Atividade hidrolítica por método tituiométrico.

A dosagem de atividade hidrolítica baseia-se na reação de hidrólise do substrato de óleo de oliva, catalisada por lipases. O óleo de oliva em

concentração de 5% m/v é empregado emulsionado com uma solução (10% m/v) de goma arábica em tampão fosfato de sódio 100mM ou tampão citrato fosfato 100mM, no pH ótimo de atuação de cada enzima. As reações são realizadas sob agitação, à temperatura constante. Após o tempo estabelecido para conservação de condições de velocidade inicial, a reação é paralisada pela adição de 20 mL de solução acetona/etano! (1:1) e procede-se a titulação com uma solução de NaOH 0,04N. Uma unidade de atividade hidrolítica (UH) é definida como a quantidade de enzima que produz 1 fimol de ácidos graxos livres por minuto nas condições de ensaio.

Para cada enzima são utilizados seus respectivos tempo e temperatura ótimos para a realização do ensaio, sendo o cálculo da atividade efetuado segundo a equação (1).

fc-F^.lOOQ ,1,

onde:

a = amostra b = branco

A = atividade lipásica (U/g)

V = volume de NaOH gasto na titulação (mL)

N = normalidade da solução de NaOH t = tempo de reação (min)

Vam = volume de amostra (mL) ou massa de enzima imobilizada (mg) Atividade de esterificação

A atividade de esterificação das enzimas imobilizadas pode ser quantificada pelo consumo de ácido (láurico ou oleico) na reação de esterificação com glicerol. Utiliza-se razão molar ácido:álcool de 3:1, à temperatura de 40°C, com 5% a 10 % m/m de enzima imobilizada sob agitação. A reação é iniciada pela adição da enzima ao meio reacional, em um reator aberto, provido de agitação e conectado a um banho termostático. Alíquotas de 150 pL são retiradas do meio reacional, em triplicata, no tempo zero e em tempos de reação determinados (t = 10, 20, 30 e 40 min), sendo diluídas em 20 mL de solução de acetona-etanol (1:1). A quantidade de ácido consumido é então determinada por titulação com NaOH 0,01 N. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que consume 1pmol de ácido láurico por minuto nas condições experimentais descritas.

O cálculo da atividade é realizado segundo a equação (2).