Método de tratamento de rejeito agroindustrial para destoxificação e redução da alergenicidade, com produção de lipases

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0703290-0 A2
  • Data do depósito:
  • 11/07/2007
  • Data da publicação:
  • 25/02/2009
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 9/14
    Enzimas, p. ex. ligases (6.); Pro-enzimas; Suas composições; Processos para preparar, ativar, inibir, separar, ou purificar enzimas; / Hidrolases (3.);
    ;
    C12R 1/80
    Micro-organismos; / Fungos; / Penicillium;
    ;
    C12S 3/10
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos; / Recupera??o ou purifica??o de material que cont?m carboidratos; / Tratamento do a??car ou mela?os;
    ;
    C12S 3/00
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos;
    ;
    C12S 3/14
    Tratamento de materiais de origem animal ou vegetal ou micro-organismos; / Recupera??o ou purifica??o de mat?rias proteicas;
    ;

MÉTODO DE TRATAMENTO DE REJEITO AGROINDUSTRIAL PARA DESTOXIFICAÇÃO E REDUÇÃO DA ALERGENICIDADE, COM PRODUÇÃO DE LIPASES. E descrito um método de tratamento de rejeito de um processo agroindustrial, que inclui uma etapa de fermentação em meio sólido com um fungo filamentoso produtor de lipases seguida por uma etapa de extração para obtenção de um extrato enzimático e um resíduo sólido destoxificado e com alergenicidade reduzida em relação ao rejeito.

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Documento

A _ (ra-r^iooor^ (2)

t-MJ

onde:

A = atividade enzimática (U/g) sendo U = 1 pmol de ácido /min.

N = normalidade da solução de NaOH.

Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra retirada no tempo zero (mL).

Vb = volume de NaOH gasto na titulação da amostra retirada após o tempo t (mL).

Vfínai = volume final de meio reacional (mL).

Ma = massa de preparação enzimática utilizada na reação (g). t = tempo de reação (min).

0 = alíquota do meio reacional retirada para a titulação.

Determinação de proteínas no resíduo sólido

Um resíduo de semente de mamona (150 mg) é triturado na forma de um pó fino e as proteínas são extraídas com 3,0 mL de água por agitação do conteúdo durante 6 h a 60°C seguido de 18 h a 37°C. Uma lama resultante é centrifugada sob 2000g durante 30 min, sendo o sobrenadante analisado por eletroforese em gel de dodecil-sulfato de poliacrilamida SDS-PAGE.

As proteínas de rejeitos fermentados tratados e in natura são solubilizadas na proporção de 3:1 em uma solução tampão (0.5M tris HCI (pH 6.8) contendo mercapto-etanol (2%) e glicerol (20%) e são separadas 5 em 12,5% de gel de acrilamida em sistema mini-proteínico de Bio Rad de acordo com Laemmli UK, publicado em Nature 1970, 227: 680-5 “Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4”.

Após a corrida, o gel é colorido por 1 h em uma solução contendo 10    0,5% de corante coomassie brilliant blue-R, em 45% de metanol e 10%

de ácido acético, e descobrido com uma solução contendo 45% de metanol e 10% de ácido acético.

O tratamento do resíduo é considerado efetivo onde não se observam bandas de proteína no gel colorido, comparado com duas 15 bandas obtidas na amostra controle.

Detecção de ricina

A concentração de ricina é determinada por densitometría ótica em bandas correspondentes a molécula de ricina. Duas bandas relacionadas à ricina são identificadas com base no peso molecular e variam em 20 intensidade segundo a eficiência do tratamento.

Separação de albumina2S

Um volume de líquido (0,5 m(_) é aplicado em coluna Sephadex G-50 pré-equilibrada com ácido trifluoracético a uma razão de 1.0 mL/min. Frações da ordem de 0,5 mL são retiradas e concentradas em um 25 evaporador rotatório para posterior determinação de albumina 2S no resíduo.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir ilustram a aplicação do método para destoxificação e redução da alergenicidade, com produção de lipases, sem 30 que os mesmos limitem o escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Este exemplo ilustra a produção de lipases, utilizando diferentes fungos filamentosos produtores de lipases, a partir de uma torta de babaçu proveniente de um processo de extração de óleo de coco babaçu.

5    A torta foi triturada e peneirada em peneiras de forma a se obter

partículas com tamanho entre 0,21 mm e 0,42mm, e a fermentação FMS foi conduzida em reatores do tipo bandeja, contendo 10g de torta em camada de 1 cm de espessura, inoculada com 1,0 x 107 esporos/g, sendo a torta suplementada com óleo de oliva.

10    Os reatores foram incubados por 72 horas, em estufa com

temperatura controlada em 30°C, com injeção de ar úmido com 95% de saturação para manter a umidade do meio em 70%.

A Tabela 1 apresenta os valores máximos de atividade lipásica e de produtividade máxima no extrato enzimático obtido, determinados pelo 15 método titulométrico, empregando óleo de oliva, nas condições ótimas de reação de cada enzima, para cada cepa de fungo filamentoso produtor de lipases.

TABELA 1

FUNGO

ATIVIDADE

PRODUTIVIDADE

(U/g)

(U/g.h)

P. restrictum

16,0

0,67

P. simplicissimum

87,0

1,21

A. parasiticus

20,7

0,43

A. sulphureus

15,5

0,22

EXEMPLO 2

Este exemplo ilustra a produção de biocatalisadores, obtidos a partir 20 do extrato enzimático proveniente do método de tratamento de um rejeito agroindustrial, que apresentam elevada produtividade e atividade lipásica.

A fermentação FMS foi conduzida em reatores do tipo bandeja, contendo 10g de torta de mamona proveniente de um processo de

biodiesel conforme descreve a patente US 7,112,229 em camada de 1cm de espessura, inoculada com 1,0 x 107 esporos do fungo P. simplicissimum para cada 1g de material.

5


A torta foi suplementada com óleo de oliva. Os reatores foram incubados por 72 horas, em estufa com temperatura controlada em 30°C, com injeção de ar com 95% de saturação de água para manter a umidade

do meio em 70%.

A Tabela 2 apresenta os valores médios de atividade lipásica do

extrato enzimático determinados pelo método titulométrico, empregando

10


óleo de oliva, em diferentes condições de temperatura e de pH.

Os resultados estão apresentados em unidade de enzima por massa substrato (U/g) e em unidade de enzima por massa de proteínas produzidas (U/mg).

TABELA 2

TEMPERATURA

(°C)

ATIVIDADE

(U/g)

ATIVIDADE ESPECIFICA (U/mg)

pH 5,0

pH 6,0

pH 7,0

pH 5,0

pH 6,0

pH 7,0

35

65,4

52,7

27,0

3,9

3,1

1,6

45

81,6

68,6

48,3

4,9

4,1

2,9

51

86,4

73,1

34,7

5,1

4,3

2,1

57

87,0

85,5

15,2

5,2

5,1

0,9

Os resultados da Tabela 2 evidenciam características ácidas e

termoestáveis para as lipases assim obtidas.


15


EXEMPLO 3

Este exemplo, Gráfico 1, ilustra a produção de lipases de P.simplicissimum, utilizando uma torta de mamona de um processo de obtenção de conforme descreve a patente US 7,112,229.

20    A fermentação FMS foi conduzida em reatores do tipo bandeja,

contendo 20g da torta em camadas de 1cm de espessura, inoculada com 1,0 x 107 esporos de uma cepa de P.simplicissimum para cada 1g de sólido. Os reatores foram incubados em estufa sob temperatura controlada e injeção de ar com 95% de saturação de água para manter a umidade em 40% m/m.

GRÁFICO 1

Ao longo do tempo de fermentação FMS foram observados maiores valores de atividade lipásica (45,2U/g, método espectrofotométrico com p-NF-laurato) utilizando a torta de mamona na faixa granulométrica de 0,850mm a 1,180mm, suplementada com 6,2% m/m de melaço, como meio de cultivo, após 72 horas.

EXEMPLO 4

Este exemplo ilustra o método de tratamento de tortas de mamona por fermentação FMS utilizando um fungo P.Simplicissimum (torta C e D) quando comparadas a amostras A e B, todas oriundas do mesmo processo de produção de biodiesel segundo a patente US 7,112,229.

As amostras foram analisadas quanto ao teor de ricina (%m/m) e de albumina 2S (U/100mg), como medida da destoxificação e da redução da alergenicidade, respectivamente, conforme apresenta a Tabela 3 que também apresenta o aspecto da fração Albumina 2S, sendo:

A - Torta de mamona in natura\

B - Torta de mamona autoclavada;

A torta A, de mamona in natura, foi analisada e os resultados obtidos foram utilizados para comparação com os das demais amostras.

5


10


C - Torta de mamona fermentada pelo fungo P.Simplicissimum por 96h; D - Torta de mamona fermentada pelo fungo P.Simplicissimum por 96h

TABELA 3

Torta

Ricina (%)

Alb 2S (%)

Aspecto da fração Alb 2S

A

1,3

0,7

isoforma alergênica dominante

B

0,18

2,2

isoforma alergênica dominante

C

Não detectada

0,4

hidrolisadas em diversas frações

D

Não detectada

0,3

hidrolisadas em diversas frações


A autoclavação da torta, amostra B, reduziu o teor de ricina em cerca de 7 vezes, entretanto, o potencial alergênico da mesma (teor de Alb 2S) aumentou cerca de três vezes.

O crescimento do fungo P. simplicissimum (amostras C e D), na torta de mamona, além de produzir lipases ácidas e termoestáveis, foi capaz de destoxificar a torta, reduzindo o teor de ricina a valores não detectados pelo método, bem como de reduzir seu potencial alergênico em aproximadamente 50% em relação à torta in natura (amostra A) através da hidrólise da albumina 2S.

EXEMPLO 5

15    Este exemplo ilustra a imobilização em suporte hidrofóbico de

lipases obtidas em um extrato enzimático recuperado do método da presente invenção, utilizando uma torta de mamona e cepas dos diferentes fungos filamentos, correspondentes aos fungos utilizados no Exemplo 1. As enzimas lipásicas foram imobilizadas em suporte hidrofóbico de 20 polipropileno microporoso.

Inicialmente, foram misturados 1000 mg do suporte em 10 mL de álcool etílico, e mantida a mistura em repouso por 30 min. Após sucessivas lavagens até total remoção do álcool, foi adicionado ao suporte 50 mL de meio fermentado livre de células.

A Tabela 4 apresenta os valores de atividade imobilizada hidrolítica Ah (determinadas pelo método titulométrico com óleo de oliva) e atividade de esterificação AE do etanol das diferentes preparações de lipases obtidas das fermentações utilizando os diferentes fungos filamentosos.

5    O fungo Penicillium simplicissimum além de apresentar

consideráveis atividades hidrolíticas na forma imobilizada apresentou elevada atividade de esterificação, demonstrando o seu potencial de aplicação para a produção de biodiesel por via enzimática.

TABELA 4

Fungo Filamentoso

Ah

Ae

Fonte de Enzima

(u/g)

(U/g)

Penicillium restrictum

64,4± 28

490 ± 80

Penicillium simplicissinum

21,7 ±4,5

1155±120

Aspergillus sulphureus

20,4 ± 5

440 ± 50

Aspergillus parasiticus

10 ± 2

2272 ± 300


Especialmente em uma torta de mamona, a aplicação do método da 10 presente invenção para destoxificação e redução da alergenicidade de rejeitos agroindustriais, possibilita agregar valor ao rejeito, produzindo também enzimas lipásicas de grande interesse biotecnológico e viabilizando a produção de biocatalisadores (lipases imobilizadas em suporte hidrofóbico) de baixo custo. Portanto, o método provê o 15 aproveitamento econômico de um resíduo agroindustrial cujo descarte representa uma ameaça para o meio ambiente.

REIVINDICAÇÕES

1. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial, contendo ricina e

albumlna 2S, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a)    Prover um rejeito agroindustrial sólido, com partículas de diâmetro entre 0,21 mm e 1,18mm;

b)    Lavar o material sólido com água, ajustando o pH na faixa entre 5,0 e 7,0 unidades;

c)    Ajustar a umidade do material sólido na faixa entre 35%m/m e 70%m/m, obtendo um substrato para fermentação em meio sólido;

d)    Conduzir a fermentação do substrato, em leito revolvido ou aerado, inoculado com um fungo filamentoso produtor de lipases na proporção entre 0,1 x 108 e 1,0 x 108 de esporos para cada 1g do material sólido, suplementado com fonte de carbono, sendo incubado em reatores sob temperatura na faixa entre 25°C e 35°C;

e)    Misturar o material sólido fermentado com uma solução tampão de fosfato de sódio na proporção de 5mL para cada 1g de material sólido e separar um extrato enzimático e um resíduo sólido;

f)    Recuperar o extrato enzimático com atividade lipásica e o resíduo sólido destoxificado e com alergenicidade reduzida em relação ao rejeito agroindustrial.

2. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por o rejeito agroindustrial apresentar concentrações de ricina entre 0,1%m/m e 2,0%m/m.

3. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por o rejeito agroindustrial apresentar concentrações de albumina 2S entre 0,1%m/m e 1,0%m/m.

4. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por o rejeito agroindustrial ser constituído por uma torta do processamento de sementes de mamona.

5. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por o rejeito agroindustrial 5 compreender uma torta subproduto de um processo de produção de biodiesel a partir de sementes de mamona.

6. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por a fonte de carbono ser selecionada entre: melaço, óleos vegetais e glicerina, na proporção entre 2%m/m e 10    10%m/m.

7. - Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a

reivindicação 1, caracterizado por o fungo filamentoso ser selecionado entre Penicillium simplicissimum, Penicillium restríctum, Aspergíllus parasiticus, Aspengillus sulphureus.

15    8.- Método de tratamento de rejeito agroindustrial de acordo com a