Método para quantificação das azadirachtinas a e b em sementes e óleos comerciais de azadirachta indica

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0700034-0 B1
  • Data do depósito:
  • 11/01/2007
  • Data da publicação:
  • 15/08/1989
  • Data da concessão:
  • 16/02/1994
Inventores:
  • Classificação:
  • A01N 43/90
    Biocidas, repelentes ou atrativos de pestes ou reguladores do crescimento de plantas contendo compostos heteroc?clicos; / tendo dois ou mais heteroan?is relevantes, condensados entre si ou com um sistema de an?is carboc?clicos comum;
    ;
    C07D 493/18
    Compostos heteroc?clicos contendo ?tomos de oxig?nio como os ?nicos hetero?tomos do anel no sistema condensado; / em que o sistema condensado cont?m tr?s heteroan?is; / Sistemas ligados em ponte;
    ;
    G01N 30/02
    Investiga??o ou an?lise de materiais pela separa??o em componentes mediante o uso da adsor??o, absor??o ou fen?menos semelhantes ou mediante o uso de troca de ?ons, p. ex. cromatografia; / Cromatografia de coluna;
    ;
    G01N 30/86
    Investiga??o ou an?lise de materiais pela separa??o em componentes mediante o uso da adsor??o, absor??o ou fen?menos semelhantes ou mediante o uso de troca de ?ons, p. ex. cromatografia; / Cromatografia de coluna; / An?lise de sinais;
    ;

MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DAS AZADIRACHTINAS A E B EM SEMENTES E ÓLEOS COMERCIAIS DE AZADIRACHTA INDICA. O método para quantificação das azadirachtinas A e B em sementes e óleos comerciais de Azadirachta indica compreende as etapas de obter um extrato de sementes, submeter este extrato e o óleo a limpeza via SPE para obter duas amostras para análise, as quais são submetidas a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), obtendo-se bandas de absorção características para azadirachtinas A e B, as quais são confirmadas por meio de espectrometria de massas; construir curvas analíticas com padronização externa para a azadirachtina A e B, obter os coeficientes de regressão a e b e o de correlação r pelo método de mínimos múltiplo quadrados levando a equação de uma reta para cada curva; determinar a concentração de azadirachtinas A e B para cada amostra padrão através da aplicação da respectiva equação à área obtida em cada uma das bandas de absorção; a média de três análises para cada amostra sendo (x) e o desvio padrão sendo (s), determinar o coeficiente de variação CV ou Precisão % através de s/x. 100 e a Exatidão através de valor obtido valor adicionado.100.

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Documento

MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DAS AZADIRACHTINAS A E B EM

SEMENTES E ÓLEOS COMERCIAIS DE AZADIRACHTA INDICA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence ao campo dos métodos de 5 quantificação de substâncias ativas presentes em sementes e óleos comerciais, mais especificamente, a um método validado para quantificação de Azadirachtinas A e B em sementes e óleos comerciais de Azadirachta indica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

10    A árvore do Nim (Azadirachta indica A. Juss. ) , de

origem asiática, é conhecida na índia como a árvore da vida, sendo utilizada como planta medicinal há séculos. As diversas propriedades inseticidas do Nim frente a mais de 400 espécies consideradas pragas agrícolas estimularam o 15 seu cultivo    mundialmente, inclusive no    Brasil. A

azadirachtina A é considerada o principal princípio ativo e produto majoritário do Nim. O grande interesse por esta e o óleo como um todo deriva do fato de que seus constituintes não são tóxicos para o homem e outros animais mamíferos, 20 além de não desenvolver resistência do inseto por ser constituído por uma mistura de vários componentes e não de um único como nos pesticidas sintéticos. Tanto o óleo como o princípio ativo isolado do Nim vem sendo mundialmente aprovado para a agricultura e pecuária orgânicas. A 25 azadirachtina A ocorre no Nim juntamente com outros isômeros (B a K) , sendo o A e o B os mais abundantes.

A    estrutura abaixo    corresponde    ao isômero

Azadirachtina A.

Existem hoje, diversos produtos no mercado preparados com o Nim. No Brasil, são encontrados o "DalNeem Óleo 100% Natural", comercializado pela Dalquim Indústria e Comércio Ltda.

10    Vários métodos cromatográficos e não cromatográficos

são descritos na literatura para a quantificação das azadirachtinas em sementes e óleos do Nim. Entre aqueles não cromatográficos, por exemplo, tem-se o colorimétrico desenvolvido por Dai, J. Yaylayan, V.A., Raghavan, G.S.V., 15 Parè,    J.R., J. Agri. J. Agric. Food Chem. 47,    3738,    1999, o

qual permite quantificar a quantidade de azadirachtinas e outros compostos estruturalmente similares nos extratos das sementes, contudo, sem uma possível caracterização e quantificação dos isômeros azadirachtinas A e B.

20    Ambrosino, P., Fresa, R, . Fogliano, V. Monti, S.M.,

Ritieni, A., J. Agric. Food Chem. 47, 5252,    1999,

desenvolveram um método qualitativo e quantitativo para a determinação das azadirachtinas em extratos crus de sementes do Nim por Cromatográfia com Fluido Supercrítico 25 (COj) , porém esta técnica é mais dispendiosa para ser empregada rotineiramente.

Schneider B.H., Ermel, K., Proc. 3rd Int. Neem Conf., Mairobi, 161, 1986, apresenta um método de quantificação por CLAE em fase reversa com extração por Soxhlet, necessitando uma grande quantidade de sementes e de

solventes, além das possibilidades de degradação do analíto devido ao aquecimento. Além disso, este método apresenta um tempo de eluição da azadirachtina A próximo a 6 min com uma baixa seletividade para o analito.

5    Thejavathi, R., Yakkundi,    S.R., Ravindranath, B., J.

Chromatography A,    705,    374,    1995, e Schaaf,    O., Jarvis,

A.P., Esch, S.A., Giagnacojo, G. , Oldham, N.I., J. Crhomatography A,    886,    89,    2000, desenvolveram métodos

similares bastante sensíveis para baixas concentrações de 10 azadirachtinas, porém, usando como detector um Espectrômetro de Massas (EM) e um CLAE no modo gradiente, sendo ambos pouco comuns em análises de rotina.

Kaushik, N.,    Anal. Bioanal.Chem.,    374,    1199,    2002,

publicou um método de CLAE-UV-DAD utilizando uma fase móvel 15 de ACN: H20    40:60    na    vazão    de 1 mL/min,    obtendo um

cromatograma com tempo reduzido de análise e possivelmente não permitindo interação eficiente entre o analito e a fase estacionária, quantificando uma banda obtida em tempo um pouco inferior a três minutos, podendo conter mais de um

20

isômero das azadirachtinas, já

que

elas absorvem

similarmente no LTV.

Shidu, O . P.,

Kumar,

V., Behl,

H.M. ,

J. Agric. Food

Chem., 51, 910,

2003 ,

apresenta

um

estudo sazonal

quantificando a azadirachtina A, porém, a principal 25 desvantagem em seu método é o tempo de análise elevado e o baixo fator de separação entre os isômeros A e B.

Numa busca prévia (de anterioridade) no Banco de Patentes Centro de Documentação e Informação Tecnológica (CEDIN), duas foram as patentes encontradas junto ao 30 Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) sobre a

Azadirachta indica. Ambas as patentes descrevem métodos de extração para o preparo de um extrato rico em azadirachtina A. Além destas, existem diversos pedidos de patentes sendo todos provenientes do exterior. Em sua maioria estes 5 pedidos descrevem processos de preparo de extratos enriquecidos em azadirachtina A. Há também pedidos de patentes que descrevem a composição de pesticidas, germicidas, xampus e sabonetes com extratos do Nim em sua formulação, produção de compostos terapêuticos; preparados 10 com derivados da árvore do Nim, com aplicação numa variedade de doenças como a malária e o câncer.

Contudo, nesta busca não foi encontrado nenhuma patente ou pedido de patente similar ao aqui apresentado. Apesar das análises existentes, um método mais econômico é 15 necessário para um controle de qualidade de sementes e do óleo comercial de Azadirachta indica, já que o consumo de derivados destes tem crescido no pais. O método reivindicado no presente pedido usa a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e foi validado.

20    SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De um modo amplo, a invenção refere-se ao desenvolvimento de Métodos Validados para Quantificação das Azadirachtinas A e B em Sementes e Óleos Comerciais de Azadirachta indica por Eluição Isocrática Através de 25 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Os padrões Azadirachtinas A e B usados no desenvolvimento dos métodos cromatográficos e na quantificação das amostras foram extraídos pelos autores do presente pedido. A validação foi feita avaliando a precisão e exatidão intra- e interdia, 30 limites de quantificação e de detecção, teste cego, medidas

de estabilidade do padrão, avaliação da eficiência do método de tratamento da amostra (Recuperação) e curva analítica com adição de padrão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

5    A FIGURA 1 anexa mostra cromatogramas de uma amostra

preparada a partir das sementes (Figura IA) e do óleo do Nim (Figura 1B),    mostrando    as bandas    majoritárias

características das azadirachtinas A e B.

A FIGURA    2    anexa é o    Espectro de    massas da

10 Azadirachtina A, ESI-MS-MS, modo negativo.

A FIGURA    3    anexa é o    Espectro de    massas da

Azadirachtina B, ESI-MS-MS, modo negativo.

A    FIGURA 4    anexa mostra    a    curva    analítica com

padronização externa para a azadirachtina A - Figura 4A -15    e    seu    isômero    B -    Figura    4B,    com    a fase móvel

H20:ACN:MeOH:THF -    61:34:4:1.    Coluna C18    Phenomenex®

Luna(II) (150x4,6mm, 5pm) ; coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3mm, 5pm). Vazão 0,8mL/min; alça de injeção de 20pL e detector de UV-Vis em 217nm.

20    A    FIGURA 5    anexa mostra    a    curva    analítica com

padronização externa para a azadirachtina A - Figura 5A e seu isômero B - Figura 5B, com a fase    móvel

H20: MeOH:ACN:THF -    51,00:36,75:7,35:4,90. Coluna C18

Phenomenex® Luna(II) (150x4,6mm, 5pm) ; coluna de segurança 25    C18    Phenomenex® (    4x3mm, 5pm) .    Vazão 0,8mL/min; alça de

injeção de 20pL e detector de UV-Vis em 217nm.

A FIGURA 6 anexa é um gráfico que mostra, na Figura 6A a curva de adição de padrão usando como matriz, sementes do Nim coletada em Catanduva-SP; fase móvel H20:ACN:MeOH:THF, 30 61:34:4:1; e na Figura 6B a curva de adição de padrão

usando como matriz óleo do Nim de Barra da Bahia-BA; fase móvel HzO:MeOH:ACN:THF,    51,00:36,75:7,35:4,90. Coluna C18

Phenomenex® Luna(II) (150x4,6mm, 5pm) ; coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3mm, 5pm) . Vazão 0,8mL/min; alça de 5 injeção de 20pL e detector de UV-Vis em 217nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção refere-se, portanto, ao desenvolvimento de métodos para o controle de qualidade de sementes e óleos comerciais de Azadirachta indica usando a técnica da 10 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

Os óleos comerciais são preparados a partir da prensa das sementes do Nim.

A quantificação das azadirachtinas A e B na semente é mais vantajosa, pois ela informa com antecedência se a 15 prensa para obter o óleo será ou não economicamente viável.

Além disso, uma comparação entre diferentes plantações pode indicar quais as melhores características de solo e clima para o cultivo, os melhores períodos de colheita, melhor forma de processamento, secagem e estocagem. No 20 controle genético das plantas, estas análises indicarão rapidamente quais exemplares levarão aos frutos com maiores teores de azadirachtinas, permitindo ao agricultor agregar valores ao seu produto. No geral os melhores resultados vêm sendo encontrados em plantações de regiões de clima quente, 25 contudo uma comparação entre as análises da semente e do óleo vem mostrando que o processamento utilizado no Brasil leva a uma perda muito grande dos princípios ativos azadiractinas A e B.

A análise do óleo de Nim com auxílio do método de 30 quantificação proposto é do interesse de empresas que o

compram para processar defensivos agrícolas, cosméticos, etc. Neste caso a análise auxiliará nas decisões de aquisição de um produto importado ou nacional, ou mesmo verificando se as diferenças de preços encontradas no 5 mercado justificam a qualidade do produto oferecido. Atualmente, algumas empresas preferem importar o óleo do Nim da índia devido à falta de dados e controles dos produtos nacionais.

Para o desenvolvimento dos métodos quantitativos, foi 10 usada a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), um método fisicoquímico de separação disponível na maioria dos centros de pesquisa e laboratórios de controle de qualidade.

O padrão usado no desenvolvimento dos métodos 15 cromatográficos e na quantificação das amostras foi extraído, isolado e identificado por Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13 C, Infravermelho, Ultravioleta, Rotação Ótica    ( [a] D) / Espectrometria    de Massas    (CL-EM;

Azadirachtina A em condições normais e deuterada) e Análise 20 Elementar.

Para o desenvolvimento dos métodos de quantificação foi utilizado um cromatógrafo SHIMADZU, contendo uma bomba LC 10-ATvp, com uma válvula seletora de solvente FCV-lOAlvp, um detector de ultravioleta de comprimento de onda 25 variável SPD-lOAvp e um auto-injetor SIL-10AF. O equipamento está acoplado a uma interface SCL lOAvp e os cromatogramas são registrados através do software CLASS-VP. A separação cromatográfica, foi realizada no modo reverso de eluição, usando uma coluna analítica octadecilsilica 30    (Cl 8) Luna' (II) Phenomenex" (150 x 4,6 mm, 5|am,    100 Ã -

Torrance, CA, U.S.A.) . Foi acoplada a esta uma coluna de segurança (Pré-coluna) utilizando um cartucho HOLDER bicompartilhado contendo, em seu interior, um cartucho de segurança C18    (4x3 mm, de 5 pm, 100 Á) também adquirido da

5 PHENOMENEX*.

Os procedimentos de limpeza da    amostra utilizados

foram Extração em Fase Sólida usando cartuchos cianopropil (BAKERBOND" SPE Cyano da J.T.Backer) de 100 mg de fase estacionária e o leito com 1 mL de capacidade. Estes eram 10 manuseados em um suporte para cartuchos (Vacuum Manifold) de 20 posições, acoplado a uma bomba de vácuo (Tecnal TE-058) . As amêndoas eram trituradas em um moinho da Tecnal TE-631, maceradas em metanol e posteriormente centrifugadas em    uma centrífuga Joan B4Í/BR41    termostatizada. O

15 sobrenadante era concentrado em evaporador de solvente a vácuo (Speedvac Plus SC 10 A, acoplado com um refrigerador, Vapor Trap RVT-4 00,    uma bomba a vácuo,    VLP-20, e    um

refrigerador Digital,    Vacuum    Gauge DVG    50, todos    da

Savant).

20    O método de quantificação de    azadirachtinas em

sementes e óleo de Nim é descrito com detalhes a seguir no presente relatório.

• Procedimento de    extração    e preparo    de amostras    de

semente de Nim

25    Inícíalmente retira-se a palha (mesocarpo) da semente,

obtendo-se apenas a    amêndoa.    Estas são    congeladas    com

nitrogênio líquido e posteriormente trituradas. Uma massa de 15mg da amêndoa da semente moída é pesada em um tubo falcon de lOmL e macerada em ImL de metanol sob agitação 3 0 (em um vortex) por 3Os e centrifugada numa temperatura de

20°C por 20 min a 10.000 rpm.

Em seguida, o sobrenadante é separado da fase sólida precipitada e transferido para um tubo de ensaio. 0 procedimento de extração é repetido mais duas vezes com a 5 fase sólida que restou no tubo falcon. Ou seja, resultando em mais dois precipitados e dois sobrenadantes, estes dois últimos são adicionados junto ao primeiro no tubo de ensaio de 5mL (coletado aproximadamente 3mL) . Este é seco por um evaporador de solventes (Speedvac) a 43°C obtendo o extrato 10 para a quantificação.

Em seguida, este extrato é submetido a um procedimento de limpeza usando a técnica de Extração por Fase Sólida (SPE). Um cartucho de SPE Ciano (lOOmg, lmL) é condicionado com 5mL de hexano, porém, sem deixá-lo secar. O extrato 15 seco no tubo de ensaio é solubilizado com 400(.tL de hexano, obtendo uma fração insolúvel e uma solúvel sendo esta última adicionada ao cartucho ciano. A fração insolúvel é lavada com mais 200ju.L de hexano obtendo mais uma fração solúvel e uma insolúvel, a solúvel também é adicionada no 20 mesmo cartucho. A solução é eluída do cartucho com 4mL de hexano deixando este secar no término dos 4mL. A fração hexânica é desprezada, pois não contém azadirachtinas.    0

restante do extrato que ficou no tubo de ensaio é então dissolvido em 600pL de MeOH, obtendo uma fração solúvel 25 aplicada ao mesmo cartucho seco, e uma fração insolúvel. Este processo se repete com mais 400|aL de MeOH, obtendo novamente duas frações uma insolúvel e outra solúvel, sendo esta última adicionada ao cartucho ciano. As frações metanólicas são eluídas do cartucho de modo a obter a

30 amostra contendo azadirachtinas. A amostra é concentrada

sob um suave fluxo de ar comprimido e reconstituída com l.OOOpL de MeOH, estando pronta para a análise. Este procedimento é feito em triplicata.

Este mesmo procedimento é feito em triplicata para 5 massas de 200, 100, 50, 20, 15, 10 e 5mg da amêndoa da semente moída, a eficiência da extração sendo constante entre as concentrações de 15 e 5mg.

• Procedimento de extração e preparo de amostras de óleo de Nim

10    O óleo de Nim é submetido a um processo de limpeza

semelhante ao utilizado para a semente. O cartucho de SPE Ciano (lOOmg, lmL) é condicionado com 5 mL de hexano, porém, sem deixá-lo secar. Uma alíquota de 10 a 15mg do óleo é solubilizado em 200pL de hexano e adicionado ao 15 cartucho. O tubo contendo o óleo é lavado com mais 200pL de hexano e a solução também adicionada no mesmo cartucho. A solução é eluída do cartucho com 4mL de hexano deixando este secar no término dos 4mL. A fração hexânica é desprezada, pois não contém azadirachtinas. O restante do 20 óleo contido no tubo de ensaio é então dissolvido em 600|aL de MeOH e aplicado ao mesmo cartucho. Este processo é repetido com mais lmL de MeOH. Esta fração metanólica é eluída do cartucho sendo coletada a amostra. A fração metanólica é concentrada sob um suave fluxo de ar 25 comprimido. A amostra é reconstituída com 500|uL de MeOH, estando pronta para a análise. Este procedimento é feito em triplicata.

Este mesmo procedimento é feito em triplicata para massas de 50, 25, 15, 10 e 5mg do óleo, a eficiência da 3 0 extração sendo constante nas concentrações de 15, 10 e 5mg.