Método, kit e iniciadores para a identificação genética de micobacterium bovis bcg cepa moreau-rj, método para monitoramento da viabilidade de bcg moreau-rj e expressão de genes, e, produtos com atividade imunobiológica

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0604958-3 A2
  • Data do depósito:
  • 23/11/2006
  • Data da publicação:
  • 06/06/2006
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 35/00
    Agentes antineopl?sticos;
    ;
    A61K 39/04
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos; / Mycobacterium, p. ex. Mycobacterium tuberculosis;
    ;
    G01N 33/50
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos;
    ;
    C07H 21/04
    Compostos contendo duas ou mais unidades mononucleot?dicas tendo grupos fosfato ou polifosfato separados, ligados por radicais sacar?deos de grupos nucleos?deos, p. ex. ?cidos nucleicos; / com desoxiribosila como radical sacar?deo;
    ;
    C12N 15/31
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas microbianas, p. ex. enterotoxinas;
    ;
    A61K 39/40
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Anticorpos; Imunoglobulinas; Imunosoro, p. ex. soro antilinfoc?tico; / bacteriano;
    ;

MÉTODO, KIT E INICIADORES PARA A IDENTIFICAÇÃO GENÉTICA DE MICOBACTERIUM BOVIS BCG CEPA MOREAU-RJ, MÉTODO PARA MONITORAMENTO DA VIABILIDADE DE BCG MOREAU-RJ E EXPRESSÃO DE GENES, E, PRODUTOS COM ATIVIDADE IMUNOBIOLOGICA - A presente invenção se refere ao mapeamento de inserções, deleções e mutações pontuais de BCG Moreau a partir da determinação da seqüência genômica de BCG Moreau e a sua comparação com o genoma de outras micobactérias. Além disso, a presente invenção identifica seqüências nucleotídicas e peptídicas que proporcionam metodologias para a verificação genética de BCG Moreau, e para a distinção de BCG Moreau de outras micobactérias, inclusive em amostras biológicas e clínicas. A presente invenção fornece, ainda, métodos e kits para a identificação de tais seqüências, dos produtos da expressão destas seqüências ou de anticorpos gerados a partir desta expressão. A invenção ainda proporciona metodologias para o monitoramento e preparação de vacinas e kits para a verificação da transcrição/expressão gênica de determinados antígenos do bacilo. A partir da presente invenção também são proporcionados produtos secundários com atividade imunomoduladora, por exemplo, no tratamento de câncer de bexiga e asma.

Página de 9

Documento

i t •    ••••

< • • • • *

"MÉTODO, KIT E INICIADORES PARA A IDENTIFICAÇÃO GENETICA DE MICOBACTERIUM BOVIS BCG CEPA MOREAU-RJ, MÉTODO PARA MONITORAMENTO DA VIABILIDADE DE BCG MOREAU-RJ E EXPRESSÃO DE GENES, E, PRODUTOS COM ATIVIDADE IMUNOBIOLOGICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao mapeamento de inserções, deleções e mutações pontuais de BCG Moreau a partir da determinação da seqüência genômica de BCG Moreau e a sua comparação com o genoma de outras micobactérias. Além disso, a presente invenção identifica sequências nucleotidicas e peptidicas que proporcionam metodologias para a verificação genética de BCG Moreau, e para a distinção de BCG Moreau de outras micobactérias, inclusive em amostras biológicas e clinicas. A presente invenção fornece, ainda, métodos e kits para a identificação de tais sequências, dos produtos da expressão destas seqüências ou de anticorpos gerados a partir desta expressão. A invenção ainda proporciona metodologias para o monitoramento e preparação de vacinas e kits para a verificação da transcrição/expressão gênica de determinados antigenos do bacilo. A partir da presente invenção também são proporcionados produtos secundários com atividade imunomoduladora, por exemplo, no tratamento de câncer de bexiga e asma.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A tuberculose (TB) é responsável anualmente pela morte de aproximadamente 2 milhões de pessoas no mundo inteiro e mais de 8 milhões de novos casos da doença são registrados a cada ano. A grande maioria das mortes (99%) e dos novos

casos registrados (95%) ocorrem em paises de média ou baixa renda, deixando clara a estreita relação entre a maior incidência de TB e baixas condições sócio-econômicas. Mycobacterium tuberculosis é o principal agente causador de tuberculose em humanos. Entretanto, Mycobacterium bovis, agente etiológico da TB bovina, também é capaz de infectar humanos, provocando um quadro de TB clinicamente indistinguível da TB provocada por M. tuberculosis. A vacina utilizada mundialmente contra tuberculose é o BCG (bacilo de Calmette e Guérin), uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis obtida no inicio do século 20 após 230 passagens (subculturas) em meio glicerinado de batata-bile por A. Calmette e C. Guérin, na França. Entre os anos de 1924 e 1926, pelo menos 34 paises receberam culturas de BCG provenientes do Instituto Pasteur. Desde então, e até o estabelecimento de lotes-semente liofilizados, o BCG foi sub-cultivado e propagado independentemente nos vários paises. Em 1947 foi realizada uma reunião internacional para debater o futuro da vacina BCG, resultando na comparação das mais de 50 sub-cepas de BCG existentes através de extensos estudos em animais e levantamento dos dados clinicos disponíveis até aquela época. Entre as diferentes cepas de BCG utilizadas atualmente estão a Connaught, Dinamarquesa (Danish) , Glaxo (Merieux) , Moreau (Rio de Janeiro), Pasteur e Tokyo. Embora o BCG seja a vacina mais utilizada mundialmente até o momento, várias dúvidas não foram esclarecidas, como por exemplo, as razões pelas quais:

a eficácia de proteção é variável (de 0 a 80%, dependendo do ensaio clinico);

as diferentes cepas de BCG apresentam graus de virulência e proteção variáveis quando avaliadas em modelos animais e também em humanos;

o(s) mecanismo (s) de ação envolvidos na proteção são pouco conhecidos;

a capacidade de conversão do teste tuberculinico varia entre diferentes cepas de BCG e vias de imunização;

embora extraordinariamente segura para uma vacina viva, o aumento da prevalência da infecção por HIV em paises endêmicos para TB levanta importantes questões relativas à segurança da vacina;

a utilização do BCG como vacina oral é, de modo geral, restrita e de variável eficiência. Entretanto, o BCG Moreau RDJ tem se demonstrado bastante eficiente neste aspecto;

o BCG (ou frações do mesmo) pode ser utilizado como adjuvante em algumas situações de imunização, mas esta aplicação precisa ser melhor estudado; e

o BCG (ou frações do mesmo) pode ser utilizado como imunomodulador em doenças como o câncer de bexiga e asma, embora o mecanismo de ação não esteja plenamente esclarecido.

Estudos recentes utilizando técnicas moleculares e genômicas, associados a um extenso levantamento histórico, foram    capazes de estabelecer uma    "genealogia"    das

diferentes cepas de BCG. O conjunto destes dados demonstra que,    quando comparado ao genoma completo de    M.

tuberculosis, cerca de 129 genes (ORFs) estão ausentes do genoma de várias cepas de BCG (regiões deletadas). Algumas deleções são comuns a todos os BCGs analizados, como uma região chamada RD1. Outras parecem ser especificas para uma determinada cepa, como a RD16 ausente na cepa BCG Moreau. Estes estudos, embora valiosos, não são capazes de identificar diferenças mais sutis entre as diferentes cepas, como mutações pontuais ou peguenas deleções/inserções, acessiveis apenas através do seqüenciamento completo do genoma (um exemplo da importância de mutações pontuais é evidenciada pela perda da capacidade de sintese de ácidos metoximicólicos nas cepas de BCG derivadas a partir de 1927, perda esta resultante da mutação de um único nucleotideo, porem esta mutação pode estar associada a um decréscimo de virulência). Poderia-se pensar que a variação da capacidade protetora do BCG, observada nos diferentes ensaios clinicos realizados, se deve unicamente à cepa de BCG utilizada; entretanto, esta não é a única explicação uma vez que resultados contraditórios foram obtidos quando a mesma cepa foi utilizada em diferentes paises. Outros fatores como a forma de preparação da vacina, a sua virulência, a forma de distribuição (eg., liofilizada), a viabilidade dos bacilos, características genéticas da população-alvo e padrão de infecção prévia por micobactérias comuns do meio-ambiente, entre outros, certamente desempenham papel importante neste quadro.

Como mostrado na Tabela 1, o BCG Moreau pode ser considerado uma cepa "antiga", mais próxima do BCG original obtido por Calmette e Guérin, apresentando uma região

deletada (RD16) única, além da região RD1 comum deletada em todas as cepas de BCG quando comparadas com a sequência de M. tuberculosis. Por outro lado, a cepa BCG Moreau não apresenta várias deleções comuns aos BCG mais "recentes".

Tabela 1

Cepa BCG

Região Deletada

Pasteur

RD1, RD2, RD14

Phipps (Philadelphia)

RD1, RD2

Frappier (Montreal)

RD1, RD2, RD8, RDFrappier

Connaught (Toronto)

RD1, RD2, RD8

Tice (Chicago)

RD1, RD2

Denmark (Danish 1331)

RD1, RD2 RDDenmark

Birkhaug

RD1

Swedwen (Gothenburg)

RD1

Glaxo

RD1, RD2, RDDenmark/Glaxo

Prague

RD1, RD2

Japan

RDl

Rússia

RD1,RDRussia

Moreau (Brasil)

RDl, RDl6

5 RD = Região deletada

Assim, podemos observar que as cepas conhecidas do BCG ainda necessitam de uma melhoria da eficácia, uma diminuição dos efeitos colaterais e, uma ampliação do controle de qualidade na produção da vacina.

10 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção, em seu aspecto mais geral, compreende o mapeamento de inserções, deleções e mutações pontuais de BCG Moreau a partir da determinação da seqüência genômica de BCG Moreau RDJ e a sua comparação com 15 o genoma de outras micobactérias.

Além disso, a presente invenção proporciona metodologias para a verificação genética do BCG Moreau, bem como para rastreabilidade, verificação de viabilidade do bacilo BCG em preparações vacinais e kits para a verificação da transcrição/expressão gênica de determinados antigenos do bacilo durante processo de crescimento e em preparações vacinais.

A partir dos métodos da presente invenção é possivel prever-se a capacidade de discriminar entre uma bactéria contendo as deleções descritas, e outras micobactérias gue não possuem essas deleções. Assim, prevê-se a capacidade de discriminar, através de análise de amostras clinicas ou de testes em pacientes, entre individuos vacinados com BCG Moreau e individuos infectados com M. tuberculosis, M. bovis, ou outra micobactéria do complexo M. tuberculosis. Torna-se também possivel, a partir do conhecimento preciso da sequencia genômica do BCG Moreau RDJ, a construção de bacilos genéticamente modificados através da introdução de fragmentos de DNA exôgenos no genoma, ou através da introdução de sequências em elementos extracromosomais, complementação de genes ausentes em BCG Moreau RDJ etc.

Um objetivo adicional da invenção se refere kits para monitoramento e rastreabilidade de BCG Moreau.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é um esquema demonstrando o arranjo de DNA das regiões INDEL No. 22 e 23.

A Figura 2 mostra uma análise em gel de agarose com a finalidade de demonstrar a capacidade da identificação genética.

A Figura 3 mostra uma outra análise em gel de agarose com a finalidade de demonstrar a capacidade da identificação genética.

A Figura 4 é um esquema demonstrando a deleção da região INDEL No. 7 e a posição dos oligonucleotideos para amplificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tendo em vista o parco conhecimento relativo às características genéticas e genômicas de BCG Moreau RDJ, (p. ex. mapeamento de mutações tais como INDELs: inserções e deleções no genoma, e mutações pontuais, responsáveis pela ausência da capacidade ou a modificação da capacidade de codificar ou expressar corretamente proteínas nestas regiões), o sequenciamento e a caracterização completa do genoma da cepa vacinai BCG Moreau RDJ se torna imprescindível.

Os estudos da presente invenção foram iniciados a partir de amostra do estoque semente para a produção da vacina BCG Moreau RDJ da Fundação Ataulpho de Paiva (FAP). Paralelamente, o conhecimento detalhado do genoma permite o desenvolvimento de metodologias rápidas, modernas, e extremamente precisas para a identificação e o controle de qualidade da vacina, bem como para o monitoramento e melhoramento de etapas de produção. Tais metodologias envolvem o desenvolvimento de kits de avaliação molecular (PCR, micro- e macroarray) e proteômica. A partir da presente invenção, é possivel a construção de vacina BCG recombinante multivalente e com grau de proteção e segurança aumentada.

Em vista disso, a presente invenção permite a melhoria da eficácia, diminuição dos efeitos colaterais e ampliação do controle de qualidade na produção da vacina utilizada no combate à doença.

A eficácia da vacina poderá ser ampliada com a reintrodução de antigenos importantes produzidos por genes que desapareceram do genoma do BCG Moreau-RDJ após anos de cultivo e passagens. Com o mapeamento do genoma do BCG Moreau, torna-se possivel melhorar a vacina através da engenharia genética, "ligando" ou "deletando" genes de acordo com sua função.

Além disso, a presente invenção proporciona mecanismos de avaliação genômica do BCG produzido, que permitirão garantir a estabilidade genética e a qualidade em diferentes condições de produção e estocagem, de forma que se tenha certeza daquilo que está sendo produzido. Além disso, a partir da presente invenção é possivel aumentar a qualidade da vacina modificando conscientemente as condições de fabricação.

A partir da invenção é possivel desenvolver vacinas recombinantes com o BCG (Bacilo de Calmette e Guérin) . Esse tipo de vacina é obtido ao se inserir no BCG os genes que codificam antigenos de enfermidades em geral. Assim, agregando geneticamente ao BCG trechos de DNA responsáveis pela sintese de antigenos de doenças como tétano e varicela, se aumenta o poder de proteção da vacina, que poderá conferir imunidade a várias doenças.

A presente invenção será descrita com base nos Exemplos a seguir, os quais não devem ser entendidos como limitativos da mesma.

EXEMPLO 1

Neste Exemplo será descrito como foi realizada a construção da biblioteca genômica. Nessa fase, o DNA do bacilo será dividido em pedaços menores, que serão inseridos em plasmideos (moléculas de DNA) de bactérias e clonados. Após    serem especialmente    preparados, os

fragmentos serão seqüenciados e analisados em computadores, que avaliarão a qualidade e encaixarão as seqüências na ordem correta, até formar o genoma completo.

Serão realizadas comparações do BCG Moreau-RJ com outras cepas, conforme Tabela 2, para identificar variações no código e na expressão dos genes, o que resultará no conhecimento detalhado sobre a evolução e as características de virulência e de sobrevida.

As etapas para identificação das variações no código e na expressão os genes são conforme abaixo apresentadas. Construção das bibliotecas genômicas de M. bovis BCG Moreau-RJ

Foram construídos dois tipos de bibliotecas genômicas de BCG Moreau-RJ, ambas a partir de DNA genômico extraido a partir de uma cultura de BCG Moreau-RDJ fornecida pela Fundação Ataulpho de Paiva. Ambas as bibliotecas foram construídas no vetor plasmidial pBluescript a partir de DNA genômico digerido, de forma parcial, com a enzima de restrição BspR I (produzida pelo LGFB, DBBM-FIOCRUZ) . Para isto, a premissa de uma digestão praticamente aleatória foi verificada através da análise do conteúdo GC previsto para o BCG Moreau-RDJ, e uma estimativa in-silico da distribuição de sitios esperados para a Bsp RI. 0 progresso de uma digestão parcial foi depois verificado através de eletroforese e visualização em gel de agarose. A primeira biblioteca, de uso rotineiro em seqüenciamento genômico, contém insertos de DNA na faixa de 2kb. A segunda, para fins mais especificos, contém insertos de DNA na faixa de 5 a lOkb.

Etapas:

1)    Extração de DNA genômico de M. bovis BCG Moreau-RDJ

2)    Digestão parcial com BspR I

3)    Fracionamento do DNA genômico digerido em gel de agarose 0,8 % e isolamento de duas populações (1,5-3 kb e 5-10 kb)

4)    Preparo de vetor de clonagem (extração de DNA, digestão com EcoR V, defosforilação, avaliação da qualidade do vetor)

5)    Ligação e transformação de Escherichia coli DH5aF' laclq

6)    Avaliação da qualidade das bibliotecas Produtos resultantes

Foram obtidas duas bibliotecas genômicas de alta representatividade (mais de 50.000 clones independentes por biblioteca).

EXEMPLO 2

Transformação das bibliotecas genômicas e preparação de DNA plasmidial

As bibliotecas genômicas (BCG:    insertos menores de

aproximadamente 2kb e BCG-L com insertos maiores de 5 a lOkb) foram semanalmente transformadas em Escherichia coli,

plaqueadas em meio seletivo e colônias isoladas repicadas em 1 ml de meio CG (placas deep well de 96 poços) . Após crescimento das culturas por 20 horas, procedeu-se à extração de DNA plasmidial através de protocolo de lise alcalina com clarificação do lisado em placas MAGV-Mi-llipore    de    96 poços.    0    DNA plasmidial foi então

precipitado com isopropanol e estocado em placas de 96 poços para seqüenciamento. Todas as placas de DNA plasmidial encontram se estocadas à -20°C. Cada DNA (clone) tem uma numeração individual, que o identifica em relação ao tipo de biblioteca, à placa e ao poço.

Por exemplo:

BCG-B120-C3 (biblioteca com insertos menores, placa de número 120, poço C3)

Cerca    de    215 placas    de    cultura de 96 poços foram

preparadas, resultando em 215 placas de DNA plasmidial de 96 poços, perfazendo    um total de    20.640 clones