Método, kit e iniciadores para a identificação genética de micobacterium bovis bcg cepa moreau-rj, método para monitoramento da viabilidade de bcg moreau-rj e expressão de genes, e, produtos com atividade imunobiológica

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0604958-3 A2
  • Data do depósito:
  • 23/11/2006
  • Data da publicação:
  • 06/06/2006
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 35/00
    Agentes antineopl?sticos;
    ;
    A61K 39/04
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos; / Mycobacterium, p. ex. Mycobacterium tuberculosis;
    ;
    G01N 33/50
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos;
    ;
    C07H 21/04
    Compostos contendo duas ou mais unidades mononucleot?dicas tendo grupos fosfato ou polifosfato separados, ligados por radicais sacar?deos de grupos nucleos?deos, p. ex. ?cidos nucleicos; / com desoxiribosila como radical sacar?deo;
    ;
    C12N 15/31
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas microbianas, p. ex. enterotoxinas;
    ;
    A61K 39/40
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Anticorpos; Imunoglobulinas; Imunosoro, p. ex. soro antilinfoc?tico; / bacteriano;
    ;

MÉTODO, KIT E INICIADORES PARA A IDENTIFICAÇÃO GENÉTICA DE MICOBACTERIUM BOVIS BCG CEPA MOREAU-RJ, MÉTODO PARA MONITORAMENTO DA VIABILIDADE DE BCG MOREAU-RJ E EXPRESSÃO DE GENES, E, PRODUTOS COM ATIVIDADE IMUNOBIOLOGICA - A presente invenção se refere ao mapeamento de inserções, deleções e mutações pontuais de BCG Moreau a partir da determinação da seqüência genômica de BCG Moreau e a sua comparação com o genoma de outras micobactérias. Além disso, a presente invenção identifica seqüências nucleotídicas e peptídicas que proporcionam metodologias para a verificação genética de BCG Moreau, e para a distinção de BCG Moreau de outras micobactérias, inclusive em amostras biológicas e clínicas. A presente invenção fornece, ainda, métodos e kits para a identificação de tais seqüências, dos produtos da expressão destas seqüências ou de anticorpos gerados a partir desta expressão. A invenção ainda proporciona metodologias para o monitoramento e preparação de vacinas e kits para a verificação da transcrição/expressão gênica de determinados antígenos do bacilo. A partir da presente invenção também são proporcionados produtos secundários com atividade imunomoduladora, por exemplo, no tratamento de câncer de bexiga e asma.

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Documento

independentes.

EXEMPLO 3

Seqüenciamento do genoma de BCG Moreau-RJ

Em seguida, foi realizado o seqüenciamento do genoma de BCG Moreau-RJ.

Os DNAs plasmidiais obtidos no Exemplo 2 acima foram seqüenciados nas duas direções com iniciadores que hibridam na região    do    vetor (F e    R:    iniciadores M13 forward e

reverse). Resumidamente, foram    feitas duas réplicas de cada

placa de estoque de DNA plasmidial em placas de seqüenciamento de 96 poços. A estas placas adicionaram-se os reagentes do kit de seqüenciamento Big Dye 3.1 (ABI) e os iniciadores, respectivamente F ou R. As reações de seqüenciamento foram submetidas à ciclagem para extensão de cadeia em termociclador de 96 poços (ABI), as reações precipitadas com isopropanol e ressuspensas em tampão de corrida. As reações de seqüenciamento assim preparadas foram lidas em seqüenciador automático 48-capilares (ABI3730) da Plataforma de Seqüenciamento de DNA RPT-01A PDTIS-FIOCRUZ. Cada placa de seqüenciamento leva 4 horas para ser processada. Os dados obtidos foram automaticamente capturados pelo servidor da Plataforma de Bioinformática RPT-04A PDTIS-FIOCRUZ através de script especialmente desenvolvido para esse fim.

Foram obtidos cerca de 50.000 "reads" (20.640 templates - 41.280 seqüências individuais + cerca de 20% de re-sequenciamentos).

As seqüências de DNA assim obtidas acima foram analisadas quanto à sua qualidade, removendo-se as regiões correspondentes à seqüência do vetor e mantendo-se as regiões do inserto seqüenciadas com qualidade superior a 20 (parâmetros usados pelo programa) através dos programas Phred e Phrap. Esses dados foram então analisados pelo programa Consed que faz a montagem da seqüência genômica a partir dos fragmentos de seqüência obtidos, unindo-os em contigs quando há regiões de sobreposição.

Assim, 37.555.553 bp foram incluidos na montagem, dos quais 23.429.107 de alta qualidade (Q>20), resultando em 5,4 vezes a cobertura do genoma em trechos de alta qualidade. A cobertura geral era de 8,5 vezes, e após montagem foram obtidos 76 contigs resultantes.

Montagem, verificação e junção de contigs

Na fase inicial do seqüenciamento genômico aleatório são obtidas quase somente seqüências únicas. A medida que o número de seqüências aumenta, começam a aparecer seqüências de- DNA que unem fragmentos isolados juntando-os em contigs. Nesse momento, o número de contigs começa a aumentar até atingir um plateau. A partir dessa etapa, começa a ocorrer a união de contigs separados e o número de contigs começa a diminuir. Idealmente, chegaríamos a um único contig, correspondente ao cromossoma único, circular, da bactéria. Entretanto, essa etapa não é atingida através do seqüenciamento aleatório (shotgun) pelas seguintes razões:

1)    Ocorrência de regiões do genoma com baixa representatividade nas bibliotecas genômicas, que não chegam a ser seqüenciadas através dessa abordagem (inerente à abordagem aleatória, aonde a distribuição da freqüência dos fragmentos especificas na biblioteca corresponde a uma curva de Gauss).

2)    Existência de regiões do genoma com elevado conteúdo G+C (característica das micobactérias em geral) que formam estruturas secundárias em forma de grampo, levando ao desligamento da DNA polimerase da fita de DNA molde, impedindo a reação de seqüenciamento.

Inicia

-se

então

a fase

de finalização

do

seqüenciamento

visando

a junção de

todos os contigs

(gap

closure) e

verificação

de regiões

com dúvidas, onde

uma

abordagem

direcionada

é empregada

para resolver esses

problemas específicos. Foram adotadas três (3) abordagens distintas para a finalização do genoma de BCG Moreau-RJ:

a)    Primer walking

Nessa abordagem são utilizados iniciadores 5 (oligonucleotídeos; primers) para o seqüenciamento da região interna de um clone específico, os iniciadores são desenhados a partir dos dados de seqüência já obtidos. Cada iniciador é único para uma região do genoma. Foram desenhados e utilizados cerca de 230 iniciadores 10 específicos nessa etapa.

b)    PCR para fechamento de gaps

Nessa abordagem, dois oligonucleotídeos são desenhados para hibridarem nas regiões flanqueadoras de um gap. Esses oligonucleotídeos são então utilizados para amplificar essa 15 região a partir do DNA genômico de BCG Moreau-RDJ. 0 fragmento de DNA obtido nessa reação de PCR é purificado e submetido ao seqüenciamento utilizando-se os mesmos oligonucleotídeos como iniciadores das reações de seqüenciamento.    Foram desenhados e utilizados 84

20 oligonucleotídeos nessa etapa.

c)    Modificações no protocolo de seqüenciamento para resolução de regiões de estrutura secundária

PCR para resolução de regiões de estrutura secundária: Essa abordagem é essencialmente idêntica à descrita no item 25 b, acima. Entretanto, nesse caso, os oligonucleotídeos desenhados são mais longos, permitindo que se realize a reação de PCR (e seqüenciamento) à uma temperatura mais elevada, o que desfavorece a formação de estruturas

secundárias no DNA. Nesta etapa foram desenhados e utilizados 48 oligonucleotideos.

EXEMPLO 5

Análise comparativa da sequência genômica, e anotação estrutural e funcional

A anotação detalhada do genoma de BCG Moreau-RJ envolve análise dos ORFs do genoma e suas següências regulatórias, a análise das vias metabólicas, a comparação com genomas de outros micobactérias (M. bovis, M. tb, BCG Pasteur etc), e a predição do impacto das deleções/inserções e mutações especificas para BCG Moreau-RJ sobre a expressão gênica, a virulência e a proteção vacinai do mesmo.

Ao final dos experimentos relatados, os inventores identificaram 23 localizações no genoma onde há diferenças de inserção (1 caso) e deleção (22 casos) quando comparados à sequência genômica de BCG Moreau RDJ com a sequência genômica de M. bovis. Para cada uma destas regiões, foi analisado o potencial impacto do INDEL sobre a capacidade codante desta região, e sobre a capacidade regulatória da região. Foram identificados ORFS (Regiões em Fase Aberta de Leitura) deletados em BCG Moreau RDJ ou cuja regulação da expressão foi afetada pelas mutações - INDELS.

A presente invenção, então, tem como escopo de proteção seqüências de nucleotideos deletados no genoma de BCG Moreau RDJ, e presentes no genoma de M. tuberculosis ou M. bovis, ou inseridos no BCG Moreau RDJ e ausentes no genoma de M. tuberculosis ou M. bovis.

Sequência nucleotidica ou seqüência de nucleotideo na

presente invenção, significa DNA dupla fita, DNA fita simples, ou produtos de transcrição destes DNAs.

As proteinas codificadas pelas regiões deletadas podem permitir a identificação de individuos vacinados com BCG Moreau de pacientes infectados com M. tuberculosis, M. bovis, ou outras micobactérias patogênicas. Esta identificação pode ocorrer através da análise de amostra clinica, como sangue, saliva, secreções, soro, biopsia, aspirado, linfa, aspirado ou lavado brônguico, liquido pleural ou outro material, ou mesmo através de teste cutâneo ou outro diretamente nos pacientes.

Tipicamente, um tal teste consistiria dos seguintes passos:

1)    Isolamento do DNA ou RNA a partir de um material biológico;

2)    A detecção das sequências de DNA especificas de micobactério presentes na amostra, ou detecção de RNA do micobactério, após produção de cDNA;

3)    Análise destas seqüências através de sequenciamento, ou através de hibridação com oligonucleotideos especificos ou com fragmentos de DNA ou RNA preparados para este fim.

A análise destas seqüências pode ser feita através de eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, revelando visualmente, após coloração, bandas de DNA do tamanho previsto a partir da análise do genoma do organismo (BCG Moreau RDJ ou M. tuberculosis ou outra micobactéria) .

A análise pode ser feita também através de hibridação com uma sonda marcada de forma não radioativa, ou radioativa. A sonda, de seqüência complementar ao DNA ou RNA a ser detectado, pode consistir de um oligonucleotideo, ou de um fragmento de DNA ou RNA. Para aumentar a sensibilidade do teste, este pode incluir o uso de técnicas de amplificação, tais como a reação de PCR ou de PCR em tempo real.

Com relação agora à Figura 1 a mesma se refere a um esquema demonstrando o arranjo de DNA das regiões INDEL No. 22 e 23. As setas indicam as posições dos oligonucleotideos de amplificação. As coordenadas numéricas se referem à seqüência de M. bovis. Mais, especificamente, a Figura 1 demonstra abordagens para discriminar por exemplo, M bovis de M. tuberculosis e de Moreau. Se presumirmos a numeração dos oligonucleotideos na Figura 1, as coordenadas numéricas 1, 2, 3, 4 e 5 (da esquerda para a direita), temos que:

(i)    1 e 2 amplificam produto de M. bovis e de M. tuberculosis, mas não amplificam Moreau;

(ii)    1 e 3 amplificam de BCG, M. bovis e M. tuberculosis, mas resultarão em fragmento bem menor, no caso de Moreau.

(iii)    4 e 5 amplificam fragmento em Moreau e em M. tuberculosis, mas não em M. bovis.

Deve ser ressaltado que a posição de complementariedade dos oligonucleotideos é indicada de forma limitada na Figura 1, porém, há bastante margem para movê-los ao longo da seqüência.

Como exemplos, foram listados conjuntos de primers flanqueando regiões de junção mencionados na Tabela 2. Estes primers amplificarão, em reação de PCR, um fragmento

com tamanho indicado na tabela quando BCG Moreau RDJ está presente na amostra, e um fragmento maior quando M. tuberculosis    ou M.    bovis estiver presente.

Alternativamente, podem ser utilizados primers que 5 amplificarão um fragmento especifico quando M. tb ou M. bovis estiver presente, mas nenhum produto quando BCG Moreau RDJ estiver presente, já que, neste caso são escolhidos primers que hibridam na região que sofreu deleção em BCG Moreau RDJ.

10    A Tabela 3 mostra a seqüência de oligonucleotideos da

presente invenção.

Com referência agora à Figura 2 a mesma mostra um gel de agarose    1% corado    com    brometo de etideo contendo    os

produtos de amplificação de DNA genômico de M. tuberculosis 15 H37Rv (canal 2), BCG Moreau (canal 3) e BCG Pasteur (canal

4) com os iniciadores RD237 e RD238. O canal 1 contém marcador de peso molecular (tamanhos moleculares indicados à esquerda    da Figura    2).    Essa análise em agarose é    um

experimento tipico de PCR para demonstrar a eficácia do kit 20 da presente invenção    para    a identificação genética.    No

experimento    mostrado    na    Figura 2, foram usados    os

iniciadores 237 e 238 (conforme Tabela 3), correspondentes às SEQ ID NO. 47 e SEQ ID NO. 48, os quais amplificam a região de junção 16.

25    A Figura 3 mostra um outro gel de agarose 1% corado

com brometo de etideo contendo os produtos de amplificação de DNA genômico de M. tuberculosis H37Rv (canais 2, 5, 8 e

11), BCG Moreau (canais 3, 6, 9 e 12) e BCG Pasteur (canais 4,    7,    10 e 13) com os iniciadores RD 251/253, RD 251/252,

RD 254/253 e RD 254/252, conforme indicado na Figura 3. 0 canal 1 contém marcador de peso molecular (tamanhos moleculares indicados à esquerda da Figura 3) .

A Figura 4 é um esquema demonstrando a deleção da região INDEL No. 7 e a posição dos oligonucleotideos para amplificação, utilizados no experimento da Figura 3. A barra rachurada representa a região deletada em BCG Moreau RDJ em relação ao M. bovis.

Assim, a partir da presente invenção é possivel utilizar os kits desenvolvidos para rastreabilidade e verificação da identidade genética de BCG Moreau RDJ, por exemplo, como passo essencial no controle de qualidade da vacina BCG Moreau RDJ, verificando identidade de inóculos para crescimento em cultura, verificação de lotes sementes, verificação de amostras de origens diversas, e verificação d estirpe infectante ou vacinante em amostras clinicas isoladas de pacientes. Isto pode ser de grande importância, quando, por exemplo, um paciente tem suspeita de sofrer de efeitos colaterais de vacinação com BCG Moreau RDJ, mas onde existe igualmente possibilidade de infecção com um micobacterium patogênico. Neste caso, a análise de uma amostra clinica, utilizando metodologias conforme descritas acima, pode indicar se há presença de BCG Moreau RDJ na amostra ou não.

Os produtos secundários da presente invenção os quais possuem atividade imunomoduladora, podem ser utilizados em doenças como o câncer de bexiga, a asma e ainda em imunodeficiências.

A Listagem de Seqüências anexa ao presente relatório relaciona as 65 seqüências de interesse da presente invenção, onde as SEQ ID NO: 47 até SEQ ID NO: 65 representam as seqüências dos oligonucleotideos de interesse particular.

Finalmente, está dentro do escopo da presente invenção, o genoma completo de BCG Moreau RJ obtido a partir do mapeamento de inserções, deleções e mutações pontuais de BCG Moreau a partir da determinação da seqüência genômica de BCG Moreau e a sua comparação com o genoma de outras micobactérias. A seqüência completa do genoma de BCJ Moreau RJ que possui 4.600.000 pares de base, obtida a partir da invenção, foi depositada no banco de dados EMBL, cujo número de acesso ainda não está disponivel.

A invenção aqui descrita e os aspectos abordados devem ser considerados como possíveis concretizações. Deve, entretanto ficar claro que a invenção não está limitada a essas concretizações e, aqueles com habilidade na técnica irão perceber que, qualquer característica particular nela introduzida, deve ser entendida apenas como algo que foi descrito para facilitar a compreensão e não podem ser feitas sem se afastar do conceito inventivo descrito. As características limitantes do objeto da presente invenção estão relacionadas às reivindicações que fazem parte da presente descrição.

Tabela 2 - INDELS

Coord. M. bovis

No.

início

fim

Tipo

Genes afetados

Observações

1

79594

79594

Insertion de 36pb

Mb0072

em fase inserção de 12 aminoácidos (possfvel maturase)

2

425072

425173

Deleção 102 pb

intergenico

Deleção de grampo entre hpsR (3') + PPE 8 (3’)

3

581752

581958

Deleção 207 pb

intergenico

Deleção de 207 pb na 5’ UTR de regX3/3’UTR de senX3 > modifica SD de regX3

4

842369

842417

Deleção de 48pb

PE-PGRS 10

em fase, deleção de 16 aa

5

1192598

1192696

Deleção de 99pb

PE-PGRS 20

em fase, deleção de 33 aa

6

1284836

1284907

Deleção de 72pb

Mb1188c

em fase, deleção de 24aa (proteína conservada rica em Ala-Pro)

7

1764646

1773892

Deleção de 9246pb

Mb1598A-1613c

Deleção "RD03": fago, região phiRvI

8

1940956

1941070

Deleção 114pb

3’ Mb1759 > 5' MB1758

intergenico - 3'UTR de possível proteína ligadora a penicillín Mb1759c

9

1980768

1980803

Deleção de 36 pb

wag22b (PE-PGRS family)

Deleção em fase de 12 aminoácidos

10

1980909

1980923

Deleção de 15 pb

wag22b (PE-PGRS family)

Deleção em fase de 5 aminoácidos

11

2321316

2321393

Deleção de 78pb

Mb2108

em fase deleção de 26aa

12

2382327

2382442

Deleção de 116pb

5' leu U

Deleção em região intergenica (perda de 2 repetições) acima de leu U

13

3011662

3011835

Deleção de 174pb

PE-PGRS 47

em fase deleção de 58aa

14

3120022

3120075

Deleção de 54pb

PE-PGRS 48

em fase deleção de 18aa

15

3201078

3202053

Deleção de 976 pb

fadD26 + ppsA

Perda da secunda metade de fadD16 + start ppsA (co-traduzido) > pode afetar tradução do resto do operon

16

3733171

3733275

Deleção de 105 pb

PE-PGRS 51

em fase deleção de 35aa

17

3769705

3777603

RD16 =Deleção de 7899 pb

Mb3433 - Mb3439c

ORFs afetados: Mb3433, Mb3434, Mb3436c, Mb3437c, Mb3438c, Mb3439c,

18

3888915

3889052

Deleção de 138pb

PE-PGRS 55

em fase deleção de 46aa

19

3890900

3891010

Deleção de 111 pb

PE-PGRS 57

em fase deleção de 37aa

20

4094370

4094428

Deleção de 59pb

intergenico

Entre DNA Q e Mb3739 - possível perda de promotores e de grampo

21

4286586

4296088

RD-01 = Deleção de 9503pb

3901-3909c

ORFS afetados: Mb3901, PE35, PPE68, esxB, esxA, Mb3906, Mb3907, Mb3908, Mb3909c

22

4307376

4307376

inserção de 1950 pb

3917c

23

4306955

4307375

deleção de 422 pb

3917c