Processo de produção de nanopartículas de prata estabilizadas por proteínas na produção de produtos têxteis antibacterianos e o tratamento dos efluentes produzidos

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0605681-4 A2
  • Data do depósito:
  • 18/09/2006
  • Data da publicação:
  • 11/09/2007
Inventores:
  • Classificação:
  • C22B 11/00
    Obten??o de metais nobres;
    ;
    D06M 11/00
    Tratamento de fibras, linhas, fios, tecidos, ou artigos ? base desses materiais, com substâncias inorgânicas ou complexo das mesmas; Tal tratamento combinado com tratamento mec?nico, p. ex. merceriza??o;
    ;

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA ESTABILIZADAS POR PROTEÍNAS NA PRODUÇÃO DE PRODUTOS TÊXTEIS ANTIBACTERIANOS E O TRATAMENTO DOS EFLUENTES PRODUZIDOS A presente invenção trata da produção de nanopartículas de prata por via biossintética utilizando extrato extracelular de fungos com atividade nitrato reductase e presença de antraquinonas derivadas. Dentre os fungos objeto da patente estão Fusarium, Piriformospora sp., Pisolithus sp, Streptomyces sp, Sporisorium sp, Penicillium sp, Neurospora sp, Aspergillus, sp, entre outros. As nanopartículas obtidas destes extratos, na ausência do fungo, possuem uma proteção protéica que estabiliza a suspensão coloidal e permite maior adesão ao tecido conferindo grande eficiência biocida. O processo de adesão das nanopartículas de prata é cíclico, sendo as nanopartículas de prata reutilizadas na impregnação de outros tecidos. No processo de lavagem as poucas partículas liberadas na água são tratadas com biomassa de Chromobacterium violaceum que atuam por bioabsorção das nanopartículas de prata, eliminando completamente a contaminação do efluente. A presente invenção terá seu uso na área da saúde, tanto humana como animal, quando da necessidade de prevenção ou tratamento de infecções por meio da impregnação de nanopartículas de prata em produtos têxteis.

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Documento

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"PROCESSO DE PRODUÇÃO    DE NANOPARTÍCULAS    DE PRATA

ESTABILIZADAS POR PROTEÍNAS NA PRODUÇÃO DE PRODUTOS TÊXTEIS ANTIBACTERIANOS E O TRATAMENTO DOS EFLUENTES PRODUZIDOS"

Campo da Invenção

A presente invenção se refere à síntese de nanopartículas de prata por um extrato fungai çom atividade de reductase e presença de derivados de antraquinona, por ex. cepas de Fusarium oxysporum, associadas a proteínas como estabilizante coloidal e de fácil aderência como material esterilizante em produtos têxteis de algodão inibindo microrganismos como Staphylococcus aureus. Esta invenção mostra o uso biológico deste material com o objetivo de tornar estéreis produtos têxteis que podem ser usados em aventais, outras vestimentas empregadas na área de saúde ou linha esportiva. Neste processo insere-se o tratamento dos efluentes após esterilização dos produtos têxteis com nanopartículas de prata com um sistema novo de biorremediação empregando a bactéria Chromobacterium violaceum que absorve as nanopartículas liberadas durante o processo de lavagem dos tecidos impregnados, evitando contaminação ambiental.

Fundamentos da Invenção    k

Os problemas com patógenos resistentes ou multiresistentes são atualmente evidentes como, por exemplo, Staphylococcus aureus resistente a meticilina e

Candida albicans resistente a fluconazole (Schaller e col. Skin Pharmacol. Physiol.

\

17, 31-36, 2004). A introdução de uma nova geração de produtos têxteis incorporando agentes antimicrobianos para evitar a contaminação por meio de feridas e infecções, tem sido avaliada (Yin e col. J. Burn Care Rehabil. 20, 195-200, 1999). É amplamente conhecido que íons de prata e compostos baseados em prata possuem forte atividade biocida. Assim, íohs prata têm sido usados em vários tipos de formulações (Sondi e Salopek-Sondi, J. Colloid Interface Sei. 275, 177-182, 2004) e, recentemente, têm se mostrado que híbridos de nanopartículas de prata com macromoléculas altamente ramificadas exibem uma superfície antimicrobiana eficiente (Aymonier et al. Chem. Commun. 24, 3018-3019, 2002). Um colóide de prata incorporado no tecido (Contreet-H ®) resulta numa

diminuição significativa de patógenos de epitélio infectado. A prata liberada aos queratinócitos infetados no ambiente úmido de cicatrização melhora a relação beneficio/risco (toxicidade) comparado com tecido sem a prata (Schaller e col. Skin Pharmacol. Physiol. 17, 31-36, 2004). Resultados similares com E. coli foram 5 obtidos com nanopartículas de prata (Sondi e Slopek-Sondi, J. Colloid Interface Sei. 275, 177-182, 2004; Baker e col. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 244-249, 2005).

Nas últimas décadas têm aumentado o interesse sobre os agentes antibacterianos em têxteis devido às diversas contaminações ambientais. A publicação de vários trabalhos na área comprova esta tendência (Yeo e col.. J.

10 Materials Sei. 38, 2143-2147, 2003; Yeo e Jeong, Polymer Intern. 52, 1053-1057, 2003). A eficácia de tecidos tratados com sistemas coloidais nanométricos tem sido demonstrada (Lee e col. J. Materials Sei. 38, 2199-2204, 2003; Lee e Jeong, Textile Res. J. 74, 442-447, 2004; Jain e Pradeep, Biotechnol. Bioeng. 90, 59-63, 2005).

15    Várias patentes relacionadas com este processo mostram que nanopartículas

de 10 a 40 nm foram preparadas com uma superfície de óxido de prata pelo método de nitrato de prata amôniacal/hidróxido de sódio/glicose/ácido nítrico. Por tanto, o produto final é oxidado na presença de surfactantes e peróxido de hidrogênio (Zhu e Zhu, W02003101200-A (2003); CN 1473553-A (2004)).

20 Nanopartículas similares de prata e óxido de zinco foram preparadas e impregnadas em tecidos têxteis (Lie e col. CN 1563553-A (2005)). Injeções de nanopartículas de prata (coloidal) em tecidos são preparadas para vestimentas hospitalares (Yang, KR 2004823557-A (2004)) e com íons de prata espalhadas nos tecidos por processo de alta pressão (Yang e Zhang, CN 1473628-A (2004)).

25 Nanopartículas de prata em pó (10-100 nm), produzidas por ultra-som, nitrato de prata/hidrazina, foram fixadas em tecido aquecendo a suspensão de nanopartículas a 60°C juntamente com o tecido sob agitação durante 30 minutos e resfriadas em seguida (Huang, CN 1557502-A (2004); Huang e col. CN1557150-A (2004)) ou de prata metálica /ácido nítrico/poliglicol/hidrazina (Huang CN 1557163-A (2004)).

30 Tecidos antibacterianos também foram obtidos por deposição de vapor de prata em tecidos na presença de argônio e sob pressão de 10 mbar as quais foram recobertas com uma camada de transporte controlado obtido pela polimerização usando plasma com 95% de oxigênio e 5% de hexametildisiloxano a 0,07 mbar (Wagener e col. W02005049699-A2 (2005)).

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Conforme assinalado acima, muitos procedimentos para obtenção de nanopartículas de prata são facilmente realizados, entretanto, a maior dificuldade é preparar partículas com tamanhos controlados. Provavelmente a síntese biológica poderia ser mais facilmente controlável do que outros métodos e, também as 5 nanopartículas seriam diretamente estabilizadas no processo (proteínas). Usando 4 as propriedades de metabolização de metais (dissimilação) por fungos, a biossíntese de nanomateriais inorgânicos usando organismos eucarióticos tais como fungos, pode ser obtida intracelularmente (Sastry e col. Current Sei. 85, 162-170, 2003) como também extracelularmente (Ahmad e col. Colloids Surf. B. 10 Biointerfaces 28, 313-318, 2003). Nesta última inovação o fungo Fusarium oxysporium, após crescimento em meio de cultura em condições adequadas, foi separado por centrifugação e a bíomassa foi lavada várias vezes com água destilada e, em seguida centrifugadas. A biomassa foi colocada em frascos cônicos estéreis e, em seguida adicionou-se nitrato de prata (solução aquosa) quando 15 finalmente o material foi incubado a 27°C. O crescimento das nanopartículas foi monitorado de tempos em tempos mostrando a produção de nanopartículas de prata na faixa de 5-100 nm (Mukherjee e col. US Patent 6.537.344 (2003)), caracterizando um intervalo bastante grande e indicando pouco controle sobre o tamanho das partículas produzidas.

20    Baseado nos métodos de produção de nanopartículas de prata descritos

acima, observa-se uma dificuldade em gerar estas partículas numa faixa estreita de diâmetro, inclusive por processo de biossíntese através de fungos (Mukherjee e cot. US Patent 6.537.344 (2003)). Os demais métodos, além da dificuldade na obtenção de nanopartículas numa faixa estreita, se valem de procedimentos 25 complexos e trabalhosos, além do potencial grave de contaminação ambiental.

Breve Descrição da Invenção

Frente aos problemas encontrados no estado da técnica, a presente invenção está relacionada com um processo de preparação de nanopartículas de 30 prata, impregnação e esterilização de tecidos com nanopartículas sem geração de efluentes. Mais especifica mente, a presente invenção está relacionada com a preparação de nanopartículas de prata que podem atuar em processos de impregnação de produtos têxteis com a finalidade de esterilizar e permitir lavagens sucessivas sem perda significativa das nanopartículas de prata. A presente

invenção descreve, mais especificamente ainda, a preparação de nanopartículas de prata através de um processo biossintético por via fúngica e sua fixação em produtos têxteis num processo de reciclagem das nanopartículas produzidas sem que ocorra sua perda para o meio ambiente (efluente zero). Também descreve o 5    tratamento do efluente obtido a partir das lavagens do tecido, de forma a não

atingir o meio ambiente com as nanopartículas que podem ser eventualmente liberadas durante o processo de lavagem dos tecidos. Tal processo envolve tratamento bacteriano para bioabsorção das nanopartículas.

10 Breve Descrição das Figuras

A seguir faz-se referência às figuras que acompanham este relatório descritivo, para melhorar entendimento e ilustração do mesmo, onde são mostrados:

Na Fig. 1, apresenta-se o espectro de absorção na região do ultravioleta-

15    visível registrado em função do tempo de reação em solução aquosa de nitrato .

reductase e antraquinona derivada contendo 10_3 M de AgN03.

É apresentado na Fig. 2 o resultado da microscopia de transmissão das nanopartículas de prata obtidas nesta patente. O diâmetro destas partículas é de 3 nm.

20    O espectro de dispersão em energia (EDS) do tecido de algodão com

nanopartículas de prata e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) das fibras deste tecido podem ser visualizadas na Fig 3.

A microscopia de varredura da fibra de algodão com a incorporação das nanopartículas de prata, após o teste de atividade antimicrobiana frente à S.

25 aureus, é apresentada na figura 4.

A Fig. 5 apresenta a microscopia eletrônica de varredura de fibras de algodão sem a incorporação de nanopartículas de prata (controle) após o teste de atividade antimicrobiana frente à S. aureus nos aumentos de 75x (A) e 1400x (B).

A Fig. 6 apresenta os espectros de UV-Vis das águas de lavagens dos tecidos

30 com nanopartículas de prata: A) antes do tratamento com C. violaceum, B) após tratamento com 102 UFC/mL de C. violaceum, C) após tratamento com 105 UFC/mL de C. violaceum, D) após tratamento com 108 UFC/mL de C. violaceum.

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Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de preparação de nanopartículas de prata, impregnação e esterilização de tecidos com nanopartículas sem geração de efluentes. Nesta invenção, vários fungos foram selecionados em 5 função da sua atividade de nitrato reductase e da presença de uma antraquinona

de acordo com os exemplos ilustrativos e não limitativos apresentados abaixo.

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EXEMPLO 1: DETERMINAÇÃO DA ANTRAQUINONA.

A antraquinona foi determinada por cromatografia de camada fina em sílica 10 gel usando clorofórmio-metanol-ácido acético (195:5:1) sendo obtido um Rf de 0,65 e, usando benzeno-nitrometano-ácido acético (75:25:2) sendo obtido um Rde 0,85, correspondendo a 2-acetil-3,8-diidroxi-6-metoxi antraquinona ou seu isômero 2-acetil-2,8- diidroxi-6-metoxi antraquinona. A estrutura foi corroborada pelos dados de fluorescência, como já descrita anteriormente na literatura (Baker e 15 Tatum, J. Ferment. Bioeng. 85, 359-361, 1998).

EXEMPLO 2: ANÁLISE DA ATIVIDADE NITRATO REDUCTASE.

A atividade de nitrato reductase foi determinada através da reação de nitrito com 2,3-diaminoftaleno como descrito na literatura (Misko e col. Anal. Biochem. 20    214, 11-16, 2003).

EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA

O crescimento fúngico em fase líquida foi feito em extrato de malte (2-4%) e extrato de levedura (0,3-1,0%) a 27-29°C por 6 dias. A biomassa foi filtrada e 25 re-suspensa em água estéril e acondicionada em faseaquosa, por 72 horas a 28°C. Após esse período, a biomassa foi filtrada gerando um extrato líquido ao qual foi adicionado AgN03 (0,1-1,5 x 10‘3 M) em 50-100 mL. A cinética de formação das nanopartículas de prata foi acompanhada por espectroscopia de absorção ultravioleta-visível até 48 horas (Fig.l). Esta preparação difere fundamentalmente 30 da patente de Mukherjee e col. US Patent 6.537.344 (2003), na qual se utilizou biomassa fúngica e água destilada junto ao nitrato de prata sendo obtidas nanopartículas de 5-100 nm. Na presente invenção, foi utilizado o líquido fungai e não a biomassa fúngica, contendo neste líquido fungai a enzima nitrato reductase e a antraquinona derivada (obtida pela incubação da biomassa durante 72 horas em

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água destilada). As nanopartículas de prata produzidas apresentaram diâmetro de 3 nm medido por microscopia eletrônica de transmissão (Fig.2).

Além de utilizar várias cepas de Fusarium oxysporium (5 de origens diferentes) foram utilizadas outras espécies de Fusarium como: subgentinans, 5 graminearum, alomini, equiseti, solaniglicerum, foram analisados outros gêneros e espécies que apresentam nitrato reductase e antraquinona derivada, como Desulfovidro sp, Piriformospora, Pisolithus sp, Streptomyces sp, Sporísorium sp, Penicillium sp, NeuroSpora sp, Aspergillus, sp,'entre outros.

As nanopartículas foram caracterizadas por espectroscopia de absorção 10 ultravioleta-visível, microscopia eletrônica de varredura e de transmissão e por fluorescência de Raio-X.

EXEMPLO 4: PROCESSO DE IMPREGNAÇÃO.

Para o processo de impregnação das nanopartículas de prata nos tecidos, o 15 filtrado final (100 mL) contendo as nanopartículas do procedimento descrito anteriormente foi ultracentrifugado e o sobrenadante foi eliminado para concentrar as nanopartículas. A suspensão de nanopartículas de prata, com aproximadamente 3 nm, foi colocada em um recipiente de vidro e o tecido submerso nesta solução por 24 h sob agitação de 600 rpm. Após este período, os tecidos foram secos a 20 uma temperatura de 60-80°C. O filtrado de nanopartículas da preparação fúngica que não fixou no tecido foi reutilizado novamente em tecido em circuito fechado . (sem geração de efluente). A presença de nanopartículas de prata nos tecidos foi verificada MEV-EDS (Fig. 3) e a concentração de nanopartículas nos tecidos foi de 2% peso/peso, analisado por fluorescência de Raio-X. Isto difere das patentes 25 citadas anteriormente (p.ex. Yang e cot. CN 1473628-A (2004); Huang e cot. CN 1557502-A (2004); Yang, KR 2004082357-A (2004)) que envolvem métodos diferentes de impregnação como alta pressão, injeção, impregnação por rolos (padding), e cujo diâmetro das partículas aplicadas é muito maior (1-100 nm) que o desta invenção.

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EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA.

A atividade antibacteriana foi avaliada frente à Staphylococcus aureus, uma bactéria Gram-positiva e frente a Klebisiela pneumoniae, uma bactéria Gram-negativa. Os tecidos foram testados, introduzindo uma amostra do tecido sobre uma cultura de S. aureus recém incaüados com uma concentração de 1,3-1,6 10UFC/mL e 0,5% de agente não iônico por 24 horas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou a ausência de microrganismos nos tecido impregnados com nanopartículas de prata, e presença naqueles não impregnados (controle) (Figs 4 e ' 5).

EXEMPLO 6: PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO DAS PARTÍCULAS LIBERADAS NAS ÁGUAS DE LAVAGENS

Os tecidos previamente impregnados com nanopartículas de prata foram lavados várias vezes (como podería ocorrer numa lavanderia) e embora a perda das partículas seja menor que 10%, este efluente foi tratado como segue: Um volume de 4 mL de uma suspensão contendo Chromobacterium violaceum CCT 3496, incubada por 12 h a 30°C em meio de glicose, peptona, extrato de levedura e triptofano foi inoculado em 100 mL da água de lavagem, coletado após 5 lavagens consecutivas do tecido. A concentração de C. violaceum inoculada foi de 102, 105 e 108 UFC/mL. As suspensões de nanopartículas de prata com C. violaceum foram mantidas sob agitação de 120 rpm a 30°C for 24 h. As águas de lavagens foram analisadas, antes e depois do tratamento, por espectroscopia de absorção ultravioleta-visível demonstrando a remoção completa das nanopartículas de prata da água quando esta foi tratada com 10a UFC/mL de C. violaceum (Fig 6).