Oligopeptídeos cíclicos inibidores de serino e treonino-protease

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0602885-3 A2
  • Número original:
  • PI 0703175-0 (Data:04/07/2007);
  • Data do depósito:
  • 21/07/2006
  • Data da publicação:
  • 06/05/2008
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 37/00
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios imunol?gicos ou al?rgicos;
    ;
    A61P 25/28
    F?rmacos para o tratamento de doen?as do sistema nervoso; / para tratamento de dist?rbios neurodegenerativos do sistema nervoso central, p. ex. agentes nootr?picos, intensificadores de cogni??o, f?rmacos para tratamento da doen?a de Alzheimer ou outras formas de dem?ncia;
    ;
    A61P 33/00
    Agentes antiparas?ticos;
    ;
    A61P 11/00
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios do sistema respirat?rio;
    ;
    A61K 38/12
    Prepara??es medicinais contendo pept?deos; / Pept?deos com at? 20 amino?cidos em uma sequ?ncia totalmente definida; Derivados destes; / Pept?deos c?clicos;
    ;
    C07K 1/16
    Processos gerais para preparação de pept?deos; / Extra??o; Separa??o; Purifica??o; / por cromatografia;
    ;
    C07K 1/06
    Processos gerais para preparação de pept?deos; / usando grupos protetores ou agentes de ativa??o;
    ;
    C07K 7/52
    Pept?deos tendo de 5 a 20 amino?cidos em uma sequ?ncia totalmente definida; Derivados dos mesmos; / Pept?deos c?clicos contendo pelo menos uma liga??o pept?dica anormal; / com apenas liga??es pept?dicas normais no anel;
    ;

OLIGOPEPTÍDEOS CÍCLICOS INIBIDORES DE SERINO E TREONINO-PROTEASE O presente pedido de patente refere-se aos oligopeptídeos cíclicos sintéticos Tnpl, Tnp2, Tnp3, Tnp4 e Thp5 capazes de inibir serino e treonino-proteases tendo, portanto, importate papel no tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias, doenças do aparelho respiratório, doenças parasitárias e doenças do sistema imunológico, podendo serem empregados em composições farmacêuticas e medicamentos para o uso na clínica médica e também na clínica veterinária.

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Documento

OLIGOPEPTÍDEOS CÍCLICOS INIBIDORES DE SERINO E TREONINO-

PROTEASE

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos oligopeptideos cíclicos sintéticos, Tnpl, Tnp2, Tnp3, Tnp4 e Tnp5, que apresentam capacidade de modular e inibir serino e treonino-preoteases apresentando desta forma, aplicações em clínica médica e veterinária em relação às patologias inflamatórias agudas e crônicas, bem como, apresenta aplicações laboratoriais diversas devido à sua capacidade de inibir tripsina e regular alostericamente a atividade proteolítica do proteassomo PT20S.

Fundamentos da Invenção

As enzimas    proteolíticas    encontram-se ubiqüamente

distribuídas em todos os tecidos e fluídos biológicos dos seres vivos e desenvolvem uma importante função no ciclo de vida das proteínas e peptídeos. A divagem proteolítica nas ligações peptídicas é uma das mais freqüentes e importantes modificações enzimáticas.

Em mamíferos, a proteólise enzimática participa de processamento e    organização    molecular das cadeias

polipeptídicas nascentes, como também dos processamentos de precursores de hormônios protéicos, receptores e fatores de crescimento, na    ativação de proteases    regulatórias

envolvidas na coagulação sangüínea, fibrinólise, na reação do sistema complemento e em muitos outros processos proteolíticos importantes para as funções celulares. Existem até o momento    cinco grandes classes    de enzimas

proteolíticas:    serinoproteases,    - cisteínoprotease,

metaloprotease, aspartilprotease e treoninaprotease. Cada uma das classes de proteases é subdividida em famílias, de acordo com a similaridade de suas seqüências primárias de aminoácidos, principalmente na região do centro-ativo. De acordo com o tipo de catálise, duas sub classes de

peptidases são conhecidas:    as exopeptidases que hidrolisam

as ligações peptidicas nas porções N-ou C-terminal do substrato e as endopeptidases que hidrolisam ligações peptidicas internas da cadeia polipeptidica. Além destas, 5 ainda são conhecidas duas outras categorias de peptidases: as oligopeptidases, endopeptidases que hidrolisam substratos de pequeno tamanho e as omegá peptidases, dipeptidases especificas que removem os residuos das porções N- ou Cl-terminais do substrato.

10    As serinopreoteases são enzimas em que o mecanismo

catalitico depende de um residuo de serina agindo como o nucleófilo para hidrolizar a ligação peptidica. São amplamente distribuídas e extremamente numerosas, estando presentes em bactérias, arqueobactérias, eucariotos, 15 bacteriófagos e virus.

Esta classe pode ser exemplificada pela tripsina pancreática, elastase e calicreina, que apresentam uma triade catalítica composta pelos residuos Asp102, His57, Ser 195 (quimotripsina). Com base nas estruturas tridimensionais 20 as 24 familias de serino-peptidases foram agrupadas em seis clãs: SA, SB, SC, SE, SF, SH. As serinoproteases do clã SA é composto por uma grande familia desta classe enzimática.

Algumas delas, como a tripsina, têm função digestiva. Outras desempenham um papel biológico mais especifico, por 25 exemplo, como reguladores, através da ativação proteolitica de proteínas precursoras, como na cascata de ativação de zimogênios que controla a coagulação sangüinea. Outras funções de serino peptidases são a regulação do sistema complemento, e a regulação celular onde algumas enzimas 30 atuam como moléculas sinalizadoras de receptores ativados por proteinases (PARs).

A    familia    da    tripsina e quimotripsina das

serinoproteases, denominada Sl, é composta por vários membros, sendo a mais numerosa desta classe enzimática.

Estas enzimas atuam, reconhecidamente, na digestão de alimentos no intestino de animais vertebrados. São enzimas sintetizadas como zimógenos inativos no pâncreas e, então, secretadas. 0 precursor da tripsina é ativado pela 5 enteropeptidase que, por sua vez, ativa os precursores da quimotripsina e da elastase. A tripsina tem sido relacionada com patologias do trato gastro-intestinal, como pancreatite crônica, gengivite e periodontite, enfisema panlobular e cirrose do figado.

10    A trombina é uma serinoprotease da familia SI formada

através de proteólise limitada da pró-trombina. O controle da atividade proteolitica da trombina é de grande interesse farmacológico, uma vez que esta enzima medeia a última etapa proteolitica, que converte fibrinogênio em fibrina.

15    Atualmente, agentes que ativam o sistema fibrinolitico

têm sido usados clinicamente na terapia trombolitica. As principais serinoproteases que participam    do sistema

fibrinolitico são a plasmina, que é ativada pelo processamento do plasminogênio pela uroquinase. Além da 20 trombina, estas duas serinoprotease, plasmina e uroquinase, têm sido alvos terapêuticos nos processos tromboliticos.

0 sistema calicreina-cinina pode ser referido como uma cascata metabólica endógena que resulta na formação de cininas bioativas (peptideos similes a bradicinina). Este 25 sistema inclui principalmente os precursores protéicos das cininas e as calicreinas plasmática e tecidual, duas serinoproteases da familia Sl. As cininas farmacologicamente ativas são consideradas pró-inflamatórias ou •cárdio-protetoras e estão envolvidas em muitos processos 30 fisiológicos e patológicos. É importante mencionar que o sistema calicreina-cinina não é mediado somente pelas cininas e seus receptores, mas também pelos seus precursores e ativadores, além dos seus inibidores endógenos (serpinas), que limitam suas atividades.

A regulação deste sistema' através de inibidores de serino proteases tem importantes implicações, tanto pela sua complexibilidade quanto pela inter-relação existente entre os sistemas renina-angiotensina, coagulação ou complemento.

5 Assim, o sistema calicreina-cinina e, portanto, as serino proteases calicreinas plasmática e tecidual são importantes alvos farmacológicos pelo seu envolvimento direto nas doenças renais e cardiovasculares; inflamação; dor (aplicações neurológicas), diabetes, doenças respiratórias e 10 angioedema.

A triptase humana é uma serinoprotease simile a tripsina encontrada nos mastócitos. Recentes estudos demonstraram que a triptase humana é mediador de uma série de patologias alergênicas e inflamatórias, incluindo rinite, 15 conjuntivite e, mais importante, asma. Além disto, a triptase também tem sido implicada em certas doenças gastrointestinais, dermatológicas e cardiovasculares. Vários inibidores desta serinoprotease vêm sendo utilizados com sucesso para o tratamento de doenças respiratórias e 20 alérgicas. A cistite intersticial é uma patologia feminina caracterizada por dor e pela exarcebação dos sintomas durante a ovulação e estresse. Vários estudos recentes têm relacionado esta patologia a atividade da triptase humana, sendo, portanto, um interessante alvo terapêutico.

25    As quimases de mamíferos (quimotripsina-simile) são

divididas em dois grupos de acordo com suas estruturas e especificidades por substratos (alfa e beta):    a quimase

humana secretada é uma alfa-quimase. Uma importante ação da alfa-quimase é a conversão da angiotensina I em II, 30 independente da ECA (enzima conversora de angiotensina), mas esta enzima também degrada proteinas da matriz, ativa o TGF-(51 e IL-ip, é processadora de endotelinas compostas por 31 residuos de aminoácidos e, finalmente, está envolvida no processamento de lipideos.

A atividade enzimática da quimase nos vasos sanguíneos, em condições fisiológicas, ainda é pouco conhecida. Por outro lado, como já mencionado, em condições patológicas, como hipertensão e ateroesclerose, a quimase pode estar 5 associada ao depósito de lipideos e hiperplasia muscular. Em adição, a quimase tem propriedades pró-angiogênica, participando de em diversas doenças como por exemplo, aneurisma da aorta. Assim, o uso de inibidores de quimase leva a possibilidade de uma terapia para doenças vasculares. 10    Enquanto as proteases da familia da tripsina são as

mais abundantes serinoproteases de animais vertebrados, a familia da subtilisina pode ser considerada composta por membros homólogos em bactérias, fungos e plantas. Esta familia é composta por éndopeptidases com ampla 15 especificidade para a hidrólise de substratos, agindo como degradadoras de proteínas (como a subtilisina). Por outro lado, também é composta por enzimas com atividade altamente seletiva, agindo como as convertases humanas e interferindo na proteólise    limitada de proteínas precursoras de

20 proteinas/enzimas e hormônios polipeptidicos.

Proteinas que são secretadas para o espaço extracelular apresentam peptideos sinais em suas porções amino-terminais (N-terminais). Estes peptideos são responsáveis    pelo

direcionamento das proteinas recém sintetizadas ao reticulo 25 endoplasmático das células eucarióticas para suas secreções. A grande maioria de enzimas processadoras de peptideos sinais são serinoproteases que atuam ma formação do complexo que transporta a proteina através da membrana do reticulo endoplasmático, liberando o peptideo sinal da proteina 30 translocada. As serinoproteases    responsáveis por    esta

atividade pertencem à familia S26 e é composta por enzimas desde bactérias até mamíferos.

Os inibidores tipo Bowman-Birk (BBIs) são os inibidores de serinoprotases mais bem estudados e encontrados

abundantemente em plantas dicotiledônias e monocotilidônias. Os BBIs purificados de monocotilidônias apresentam peso molecular de 8 kDa para cada sitio reativo (que estão em uma única superficie exposta). Assim, estes BBIs são 5 subdivididos em duas classes:    BBIs de 8kDa com um sitio

reativo e os BBIs de 16 kDa, compostos por dois sitios reativos. 0 inibidor denominado SFTI-1 (sunflower trypsin inhibitor-1) é um peptideo biciclico composto por 14 residuos de aminoácidos e é, até o momento, o menor e mais 10    potente inibidor    natural tipo    Bowman-Birk.    Atualmente, o

SFTI-1 tem sido    utilizado contra patógenos    e insetos em

plantas trangênicas. O SFTI-1 também pode ser utilizado na„ prevenção do câncer, dengue e doenças inflamatórias e alérgicas.

15    O mais importante sistema proteolitico para a

degradação de proteinas intracelulares é o sistema ubiquitina-proteassomo. As proteinas passiveis de degradação por esse sistema são marcadas com cauda de poli-ubiquitina que por sua vez é reconhecida por unidades regulatórias do 20    proteassomo 26S que irá então,    processar a    proteina para

hidrólise. O processamento consiste na desubiquitinação, desdobramento e translocação da proteina para a câmera catalitica proteassomo - PT20S. A proteina será hidrolisada gerando peptideos que    variam de    3-25 residuos    de

25    aminoácidos. O padrão mais comum é de peptideos de 7-9

aminoácidos. Os peptideos gerados não se acumulam na célula sendo imediatamente processados por peptidases ou utilizados para a apresentação antigênica.

A estrutura do proteassomo 26S consiste de uma unidade 30    catalitica central    denominada de    20S (700 kDa)    flanqueada em

ambas extremidades por unidades regulatórias responsáveis pelo reconhecimento da    cauda    de    poli-ubiquitina    e

processamento da proteina a ser hidrolisada. O PT20S é uma treonina protease da familia Ntn hidrolases ("N-terminal

nucleophile hydrolases").    0 sítio ativo treonina (ThrlO7)

localiza-se no N-terminal de subunidades (3.

Uma das funções já bem definida dos heptâmeros formados por subunidades a flanqueando os heptâmeros P da porção 5 catalítica da unidade 20S é a de regular a entrada de substrato na porção catalítica. As subunidades a e P possuem massa molecular compreendida entre 21-33 kDa. 0 PT20S é um complexo multi-catalítico. Apresenta três atividades distintas denominadas de:    (1) tipo quimiotripsina (ChT-L); o

10 sítio ativo ThrlOv está localizado na unidade p5;    (2) tipo

tripsina (T-L); o sítio ativo está localizado na unidade P2 e (3) atividade pós-ácídica ou peptidil-glutamil peptidase (PGPH), também dita tipo caspase com o sítio ativo na unidade pi. Os substratos peptídicos mais comumente 15 utilizados experimentalmente para acessar cada uma das três diferentes atividades são: suc-LLVY-MCA (ChT-L); boc-LRR-MCA (T-L) e z-LLE-MCA (PGPH).

Tanto a entrada do substrato quanto cada um dos sítios catalíticos que determinam as diferentes atividades sítio-20 específicas do PT20S é passível de regulação.

Com relação a função o proteassomo em células eucarióticas é responsável por 80% da degradação protéica de material intracelular (citoplasma, retículo endoplasmático e núcleo). Este complexo catalítico ocupa papel central na 25 regulação celular (ciclo; resposta e sinalização) sendo ainda essencial para a eliminação de proteínas que tiveram erro de transcrição/transdução. Tem também papel na eliminação de proteínas modificadas oxidativamente. O proteassomo é uma protease encontrada em todos os organismos 30 eucarióticos e o de mamíferos está também envolvido no processo de apresentação antigênica pelos complexos de histocompatibilidade MHC de classe I.

0 sistema Ub-proteassomo tem papel critico na regulação celular através da divagem de proteinas regulatórias de vida média curta. 0 proteassomo é o principal responsável em mamíferos pela geração de peptideos utilizados pelos 5 complexos de histocompatibilidade (MHC I) para a apresentação antigênica. A via envolve a degradação de proteinas endógenas e proteinas virais, gerando fragmentos que são transportados para o reticulo endoplamático pelas proteinas transportadoras denominadas TAP. Dentro do 10    reticulo, os    peptideos se ligam    às moléculas do MHC de

classe I e    são    subseqüentemente    expostos na superfície

celular.

O processo pelo qual proteinas são selecionadas para gerarem peptideos    que serão utilizados na apresentação

15 antigênica não está elucidado. Existem três hipóteses correntes e não excludentes sobre esse mecanismo.

Sabe-se que certas patologias estão relacionadas à atividade catalítica do proteassomo e, portanto, à unidade 20S. Portanto, podemos citar:    o efeito anti-tumoral

20    desempenhado    pelo    proteassomo na    degradação de proteinas

reguladoras dos processos de apoptose, ciclo celular e produtos de oncogenes o tornaram alvo terapêutico na quimioterapia anti-tumoral; o efeito anti-inflamatório gerado pela degradação do IkB pelo PT20S e conseqüente 25 ativação do fator de transcrição NFkB, o tornaram alvo para a investigação de efeito anti-inflamatório através de seus inibidores; o proteassomo possui atividade antigênica por gerar produtos de hidrólise protéica que são utilizados na apresentação    antigênica    por    complexos    de

30 histocompatibilidade MHC I. Consequentemente, a modulação de sua atividade é critica na resposta anti-viral, na remoção de células cancerígenas e nas doenças auto-imunes; o PT20S degrada o fator induzivel de hipóxia HIF-la, proteina reguladora da homeostase de O2 e do processo de angiogênese

atuando diretamente em cardiopatias e acidentes vasculares; em doenças neurodegenerativas sabe-se a formação de placas e depósitos protéicos (amilóide; prions) obs-ervados em algumas doenças neurodegenerativas (Alzheimer; Parkinson) são 5 conseqüência do acúmulo de proteinas alteradas que não são mais passíveis de degradação pelo proteassomo. Outros exemplos são patologias tais como Huntington e ataxia, comumente referidas como "proteasome storage diseases", nas quais o PT20S está bloqueado por poliglutamina e, portanto 10 inibido.