Tipagem molecular de fungos do complexo cryptococcus neoformans através da técnica de pcr-rflp

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0602571-4 A8
  • Data do depósito:
  • 19/06/2006
  • Data da publicação:
  • 06/02/2008
Inventores:
  • Classificação:
  • C12Q 1/68
    Processos de medi??o ou ensaio envolvendo enzimas ou micro-organismos; Composições para esse fim; Processos de preparação de tais composições; / envolvendo ?cidos nucleicos;
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TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP é uma metodologia que visa a tipagem molecular do fungo Cryptococcus neoformans na qual um fragmento de DNA de 597pb do gene CAP59 é amplificado pela PCR e clivado com uma mistura de duas endonucleases de restrição (enzimas comerciais) por 3 horas à temperatura de 37C e os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado pelo brometo de etidio e visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta (UV) e/ou registrado em sistema de fotodocumentação; e a clivagem deste fragmento de 597 pb pelas enzimas de restrição indicad,s permite tipificar as amostras de acordo com os sorotipos definidos pelo kit Cryptocheck

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Documento

TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP

Trata-se de uma metodologia que visa atipagem molecular do fungo Cryptococcus neoformans na qual um fragmento de DNA de 597pb do gene CAP59 é amplificado pela 5 PCR e clivado com uma mistura de duas endonucleases de restrição (enzimas comerciais) por 3 horas à temperatura de 37°C. Os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado pelo brometo de etídio e visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta (UV) e/ou registrado em sistema de fotodocumentação.

A criptococcose é uma doença iungica causada por fungos do complexo 10 Cryptococcus neoformans que inclui as espécies (Cryptococcus neoformansCryptococcus gattii). A espécie C. neoformans, possui duas variedades var grubii (sorotipo A) e var. neoformans (sorotipo D) e um híbrido AD, a espécie Cryptococcus gattii compreende os 2 sorotipos B e C. No meio ambiente ambas as espécies apresentam características ecológicas distintas. Estes fungos possuem uma considerável variabilidade 15 genética e são agrupados em 5 sorotipos distintos baseados no reconhecimento de antígenos da cápsula através de anticorpos monoclonais. Até meados de 2005, a tipagem deste fungo era feita através do kit Cryptocheck, produzido pela Empresa IATRON do Japão, que recentemente descontinuou a produção do kit. Além disso, o custo para a tipificação do fungo pelo kit Criptocheck é de aproximadamente 14 dólares americanos 20 por amostra, incluindo o preço do material e as taxas de importação. A tipagem de cada amostra, incluindo o seu cultivo apresentou um valor aproximado de 2 dólares americanos ou seja cerca de 7 vezes menos que o custo da metodologia de sorotipagem pelo Cryptochek.

A técnica da PCR (reação em cadeia de polimerase) permite a amplificação in vitro 25 de genes ou fragmentos de genes de interesse a partir de uma molécula de DNA molde

utilizando iniciadores específicos em uma solução tampão de reação adequada No caso em pauta, utilizou-se os iniciadores CAP59F 5’-GAG TGT CTC CGC AAC CCG CA-3’ e CAP59R 5’-CCT ACT CTG CCA AAT CAA CTC-3’ descritos por Nakamura et al. (2000) para amplificação de um fragmento de 597pb do gene CAP59, que possui 30% da 5 seqüência codificante do exon de maior tamanho do fungo Cryptococcus neoformans. A técnica de RFLP (Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição) baseia-se na divagem do DNA em seqüências específicas de nucleotídeos (sítios de restrição) através de endonucleases de restrição. A metodologia é altamente reprodutível e padrão dos fragmentos de DNA produzidos, permitem a tipagem molecular 10 do fungo. Neste caso foram utilizadas as endonucleases comerciais AvaII (Gibco®) e Haelll (Invitrogen®).

As patentes US2005164243, W003052076 e PI9813417-5 tratam de assunto correlato, mas não apresentam as características do invento em questão por tratarem apenas de métodos de detecção e identificação do fungo Cryptococcus neoformans.

15    O objetivo da presente invenção foi desenvolver uma técnica de tipagem genética

baseada na metodologia de PCR-RFLP do fragmento do gene CAP59 para, através dos perfis de restrição identificar padrões genéticos correspondentes aos cinco diferentes sorotipos de Cryptococcus neoformans identificados pela sorotipagem pelo kit Criptocheck. A técnica de tipagem genética, descrita neste relatório, está caracterizada 20 pelas etapas da metodologia, abaixo identificadas:

1. O fragmento do gene CAP59 de 597pb é amplificado a partir de amostras de DNA purificado ou de leveduras íntegras provenientes de cultura através do uso de iniciadores específicos (CAP59F e CAP59R) pela reação da PCR em condições apropriadas.

2. O fragmento do gene CAP59 de 597pb amplificado é submetido à digestão enzimática com as endonucleases de restrição (Avall e HaeYK) para gerar fragmentos de restrição que após eletroforese em gel de agarose 1,5% corado pelo brometo de etídio irão compor perfis de restrição que permitem a identificação dos diferentes tipos moleculares do fungo 5 que guardam uma estreita correlação com os sorotipos.

A Figura 1 mostra os fragmentos do marcador de tamanho molecular (DNA de plasmídeo PUC-18 digerido coma enzima HaelW) (1), e o fragmento amplificado de 597 pb do gene CAP59 das amostras (2, 3, 4, 5, 6 e 7) de C. neoformans. A linha 8 corresponde ao controle negativo (sem adição de DNA molde).

10    A Figura 2 é um desenho esquemático do padrão de tamanho molecular (DNA de

plasmídeo PUC-18 digerido com a enzima HaeJÍI) (1), e do perfil de restrição do fragmento de 597 pb do gene CAP59 das amostras de C. neoformans dos diferentes sorotipos clivadò com as enzimas de restrição AvaU e HaeEL Sorotipo A (2, 3 e 4), sorotipo B (5 e 6), sorotipo C (7); sorotipo D (8 e 9), sorotipo AD (10 e 11), Controle (12): 15 produto amplificado de 597 pb não digerido.

Amostras padrões de Cryptococcus neoformans sorotipos A (ATCC-LMM794), B (ATCC-LMM799), C (ATCC-LMM801), D (ATCC-LMM797) e AD (ATCC-LMM796) e 17 amostras sorotipo A; 7 amostras sorotipo B, 6 amostras sorotipo D e uma amostra sorotipo AD do Laboratório de Micologia do Centro de Biotecnologia da UFRGS, do Rio 20 Grande do Sul foram crescidas sob agitação (150 rpm) em meio de cultura CG líquido (Cicie Grow, USB®) a 37°C por 16 horas em estufa bacteriológica. Um mililitro de cultura com densidade óptica (D.O.) 2,0 foi transferido para um tubo de 1,5 mL, centrifugado a 5.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante descartado e a seguir o sedimento foi adicionado de 500 pL de água deionizada ultrapura estéril e vigorosamente

homogeneizado em agitador orbital por 1 minuto. Três microlitros da amostra foram submetidos à amplificação do fragmento do gene CAP59 em volume final de 20 pL, contendo: 1 U da enzima Taq DNA polimerase (LabTrade®), 2 mM de cada dideoxinucleotídio trifosfatado (dNTP), 10 pmol de cada iniciador (CAP59-F 5’-GAG 5 TGT CTC CGC AAC CCG CA-3’ e CAP59-R 5’-CCT ACT CTG CCA AAT CAA CTC-3’) em um tampão contendo (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCh). A amplificação das amostras foi efetuada através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) em termociclador Eppendorf Mastercycler nas seguintes condições térmicas: denaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C por 1 10 minuto, ligação do iniciador 60°C por 2 minutos, extensão a 72°C por 3 minutos e uma extensão final de 5 minutos a 72°C. Para visualização, 3 pL do produto de amplificação foram adicionados de tampão de amostra 2x (0,08% de azul de bromofenol, 0,08% de xileno cianol e 10% de glicerol) volume/volume (v/v) e submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% a 100V por 1 hora em tampão TBE (0,1M Tris-HCl, 0,1M ácido bórico, 15    200mM EDTA pH 8,3). Após a eletroforese, o gel foi corado por imersão em uma solução

de brometo de etídio (0,5 pg/ml) por 10 minutos, sendo os produtos de amplificação visualizados em transiluminador de luz ultravioleta modelo Macro Vue UV 20® (Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco) e documentado em sistema de fotodocumentação digital. Cinco microlitros do produto amplificado de 597pb obtido através da reação de 20 amplificação (PCR) do fragmento do gene CAP59 de amostras dos sorotipos A, B, C, D e AD foram submetidos à divagem com uma mistura das endonucleases (enzimas comerciais) AvaII e HaeWl contendo 1 U de cada enzima em 2 pL do tampão recomendado pelo fabricante adicionado de água deionizada ultrapura estéril para um volume final de 20 pL e incubado por 3 horas à temperatura de 37°C em banho-maria. Os

produtos de digestão foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose 1,5% corados pelo brometo de etídeo.

A tipagem pelo Criptocheck é uma tipagem fenotípica (i.e.) está baseada na diferença de composição do principal polissacarídeo capsular (glucoroloxilomanana) do 5 fungo e o reconhecimento destes antígenos por anticorpos monoclonais. Em algumas situações o fungo não pode ser tipado devido a alterações nos componentes da cápsula os quais não são reconhecidos pelo kit de sorotipagem. A tipagem através da PCR-RFLP é uma tipagem molecular baseada na sequência de nucleotídeos do exon (parte codificante) do fragmento do gene CAP59. Este fragmento pode ser amplificado a partir de amostras 10 de DNA purificado ou de leveduras obtidas diretamente de cultura sem necessidade de extração prévia e de purificação de DNA. A divagem deste fragmento de 597 pb pelas enzimas de restrição indicadas permite tipificar as amostras de acordo com os sorotipos definidos pelo kit Cryptocheck.

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REIVINDICAÇÕES

1.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP irão compor perfis de restrição que permitem a identificação dos diferentes tipos moleculares do fungo que guardam uma estreita correlação com os sorotipos, caracterizado pelo fragmento do gene CAP59 de 597pb ser amplificado a partir de amostras de DNA purificado ou de leveduras íntegras provenientes de cultura através do uso de iniciadores específicos (CAP59F e CAP59R) pela reação da PCR em condições apropriadas; e o fragmento do gene CAP59 de 597pb amplificado ser submetido à digestão enzimática com as endonucleases de restrição (AvaU e HaelII); e os fragmentos de restrição gerados serem submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado pelo brometo de etídio.

2.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas amostras padrões de Cryptococcus neoformans sorotipos A (ATCC-LMM794), B (ATCC-LMM799), C (ATCC-LMM801), D (ATCC-LMM797) e AD (ATCC-LMM796) e 17 amostras sorotipo A; 7 amostras sorotipo B, 6 amostras sorotipo D e uma amostra sorotipo AD do Laboratório de Micologia do Centro de Biotecnologia da UFRGS, serem crescidas sob agitação (150 rpm) em meio de cultura CG líquido (Cicie Grow, USB®) a 37°C por 16 horas em estufa bacteriológica.

3.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um mililitro de cultura com densidade óptica (D.O.) 2,0 ser transferido para um tubo de 1,5 mL, centrifugado a 5.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante descartado e a seguir o sedimento ser adicionado de 500 pL de água deionizada ultrapura estéril e vigorosamente homogeneizado em agitador orbital por 1 minuto.

4.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por três microlitros da amostra serem submetidos à amplificação do fragmento do gene CAP59 em volume final de 20 pL, contendo: 1 U da enzima Taq DNA

5 polimerase (LabTrade®), 2 mM de cada dideoxinucleotídio trifosfatado (dNTP), 10 pmol de cada iniciador (CAP59-F 5’-GAG TGT CTC CGC AAC CCG CA-3’ e CAP59-R 5’-CCT ACT CTG CCA AAT CAA CTC-3’) em um tampão contendo (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1,1,5 mM MgCl2).

5.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans 10 ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pela amplificação das amostras ser efetuada através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) em termociclador Eppendorf Mastercycler nas seguintes condições térmicas: denaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, ligação do iniciador 60°C por 2 minutos, extensão a 72°C por 3 minutos e 15 uma extensão final de 5 minutos a 72°C.

6.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela visualização, onde 3 pL do produto de amplificação foram adicionados de tampão de amostra 2x (0,08% de azul de bromofenol, 0,08% de xileno cianol e 10% de

20 glicerol) volume/volume (v/v) e submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% a 100V por 1 hora em tampão TBE (0,1M Tris-HCl, 0,1M ácido bórico, 200mM EDTA pH 8,3).

7.    TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo gel, que após a eletroforese, ter sido corado por imersão em uma

solução de brometo de etídio (0,5 pg/ml) por 10 minuto8. TCP AGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos produtos de amplificação serem visualizados em transiluminador de luz ultravioleta, modelo Macro 5 Vue UV 20® (Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco) e documentado em sistema de fotodocumentação digital.

9. TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Cinco microlitros do produto amplificado de 597pb obtido através da 10 reação de amplificação (PCR) do fragmento do gene CAP59 de amostras dos sorotipos A, B, C, D e AD serem submetidos à divagem com uma mistura das endonucleases (enzimas comerdais) A valí e Haelll contendo 1 U de cada enzima em 2 pL do tampão, adicionado de água deionizada ultrapura estéril para um volume final de 20 pL e incubado por 3 horas à temperatura de 37°C em banho-maria

1    2    3    4    5    6    7    8

FIG.2

12    34    567    8    9    10    11    12


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5    6


RESUMO

TIPAGEM MOLECULAR DE FUNGOS DO COMPLEXO Cryptococcus neoformans ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RFLP é uma metodologia que visa a tipagem molecular do fungo Cryptococcus neoformans na qual um fragmento de DNA de 597pb 5 do gene CAP59 é amplificado pela PCR e clivado com uma mistura de duas endonucleases de restrição (enzimas comerciais) por 3 horas à temperatura de 37°C e os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado pelo brometo de etídio e visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta (UV) e/ou registrado em sistema de fotodocumentação; e a divagem deste fragmento de 597 pb pelas enzimas de 10 restrição indicad,s permite tipificar as amostras de acordo com os sorotipos definidos pelo kit Cryptocheck