Processo de preparação de vacina contra a pneumonia enzoótica suína e vacina obtida

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0603619-8 A2
  • Data do depósito:
  • 16/05/2006
  • Data da publicação:
  • 15/01/2008
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 15/09
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante;
    ;
    C12N 15/31
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas microbianas, p. ex. enterotoxinas;
    ;
    A61K 39/02
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos;
    ;

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE VACINA CONTRA A PNEUMONIA ENZOÓTICA SUÍNA E VACINA OBTIDA É descrito um processo de preparação de uma vacina de subunidade contra a pneumonia enzoótica suína (PES), a vacina sendo obtida através da tecnologia do DNA recombinante. A vacina é composta pela quimera recombinante "rLTBRl", uma proteína formada pela fusão da subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) com a região repetitiva R1 da adesína P97 de Mycoplasma hyopneumoniae (R1), agente etiológico da PES. A LTB apresenta atividade adjuvante, ou seja, potencializa a resposta imune frente a antígenos co-administrados ou fusionados, que na invenção é constituído pela região repetitiva R1 da adesina P97 de Mycoplasma hyopneumoniae. Os genes que codificam para a LTB e R1 foram amplificados por PCR, fusionados "in vitro" e o produto resultante (gene híbrido) clonado em um plasmídeo de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante rLTBR1 (vacina) foi produzida em E. coli purificada, caracterizada e avaliada em camundongos isogênicos e suínos SPF (specific pathogen free). rLTBR1 administrada por via intranasal protegeu leilões SPF desafiados com uma cepa patogênica de Mycoplasma hyopneumoniae.

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Documento

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE VACINA CONTRA A PNEUMONIA ENZOÓTICA SUÍNA E VACINA OBTIDA CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence ao campo das vacinas contra pneumonia 5 causada por Mycoplasma hyopneumoníae, mais especificamente, a um processo de preparação de uma vacina de subunidade recombinante (rLTBRI) contra a Pneumonia Enzoótica Suína (PES) composta pela fusão da subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB - adjuvante) com a região repetitiva R1 da adesina PS7 de Mycoplasma hyopneumoníae (R1 - imunógeno).

10 FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A Pneumonia Micoplásmica ou Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada pela bactéria fastidiosa Mycoplasma hyopneumoníae, é a doença respiratória mais importante dos suínos.

M. hyopneumoníae coloniza e destrói o principal mecanismo inespecífico 15 vde defesa do trato respiratório, o elevador mucociliar, conforme citado em artigo ,por Debey, M.C and Ross, R.F. Ciliostasis and loss of cilia induced by Mycoplasma hyopneumoníae in porcine tracheal organ cultures. Infection and Immunity, 62, p.5312-5318, 1994, predispondo os suínos a patógenos secundários, conforme Ciprian A, et al Mycoplasma hyopneumoníae increases the 20 susceptibility of pigs to experimental Pasteurella multocida pneumonia. Canadian Journal of Veterinary Research, 52, p.434-438, 1988; Debey M.C. and Ross, R.F. Ciliostasis and loss of cilia induced by Mycoplasma hyopneumoníae in porcine tracheal organ cultures. Infection and Immunity, 62, p.5312-5318, 1994; Thaker E.L. et al., Mycoplasma hyopneumoníae potentiation of porcine reproductive and 25 respiratory syndrome virus-induced pneumonia. Journal Clinicai of Microbiology, 37, p.620-627, 1999, por isso é o alvo central de um programa sanitário para doenças respiratórias de suínos.

A PES é uma doença infecciosa crônica, muito contagiosa, caracterizada por uma broncopneumonia catarral que geralmente cursa com complicações 30 broncopulmonares purulentas e que se manifesta por tosse seca e atraso no crescimento. A enfermidade possui alta morbidade e baixa mortalidade e as perdas econômicas são decorrentes de quedas na produtividade que podem

chegar a 20% sobre a conversão alimentar e até 30% sobre o ganho de peso, dependendo da gravidade das lesões e das infecções secundárias, conforme citado em Sobestiansky J. et al., Pneumonia enzoótica. In: Clínica e Patologia Suína. 2a ed., Art 3 Impressos Especiais, Goiânia, Goiás, p.359, 1999.

5    Um estudo realizado pelo Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves

(CNPSA - EMBRAPA, Concórdia, SC), onde foram avaliados 3.788 suínos de granjas da região sul do país, revelou que as perdas estimadas de peso devido a lesões pneumônicas, desde o nascimento ao abate, foram de 2,52 kg/suíno abatido, vide Sobestiansky, J. et al., Estudos ecopatológicos das doenças 10 respiratórias dos suínos: Prevalência e impacto econômico em sistemas de produção dos estados de SC, RS e PR. EMBRAPA-CNPSA, 2001, p.6 EMBRAPA-CNPSA. Comunicado Técnico 287, o que leva a uma estimativa de perda de aproximadamente 80 milhões de reais por ano. Um levantamento realizado em granjas comerciais localizadas na região sul do país constatou que 15    55% dos suínos de abate tinham lesões sugestivas de PES e 100% dos rebanhos

examinados estavam afetados, conforme Sobestiansky J. et al., Estudos ecopatológicos nas fases de crescimento e terminação: prevalência de rinite atrófica e de pneumonia nas fases de crescimento e terminação na região sul do Brasil. Anais IX ABRAVES, Belo Horizonte, p. 171-172, 1999.

20    Os micoplasmas são os menores organismos autoreplicantes conhecidos,

possuem genomas pequenos (580 a 1350 kb) e são desprovidos de parede celular. São de difícil cultivo “in vitro”, sendo que a maioria das espécies nunca foi cultivada, vide Razin S. et al., Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, p. 1094-1156, 25    1998. M. hyopneumoniae, por outro lado, é cultivável “in vitro", porém exige meio

complexo e enriquecido com soro suíno livre de anticorpos anti-M. hyopneumoniae. Este fato, somado ao seu crescimento pobre e lento (Ross, R.F. Mycoplasmal diseases. In: Diseases of Swine. Ed. 8o, lowa State University Press, Ames, lowa, p.495-510, 1999; Sobestiansky J. et al., Pneumonia enzoótica. In: 30 Clínica e Patologia Suína. 2a ed., Art 3 Impressos Especiais, Goiânia, Goiás, p.359, 1999; Walker, R.L. Mollicutes. In: HIRSH, D.C., ZEE, Y.C. Microbiologia Veterinária, 1a ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, Brasil, p.155-162, 2003

encarece excessivamente a produção de vacinas preparadas com bactérias inteiras inativadas (bacterinas), que são as mais utilizadas no controle da PES, vide Ross, R.F. Mycoplasmal diseases. In: Diseases of Swine. Ed. 8o, lowa State University Press, Ames, lowa, p.495-510, 1999; Fagan P.K. et al., Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopneumoniae antigen (NrdF). Infection and Immunity, 65, p.2502-2507, 1997; Chen J.R.et al., A recombinant chimera composed of repeat region RR1 of Mycoplasma hyopneumoniae adhesin with Pseudomonas exotoxin: in vivo evaluation of specific IgG response in mice and pigs. Veterinary Microbiology, 80, p.347-357, 2001. As bacterinas utilizadas no controle da PES constituem o medicamento mais oneroso no custo de produção de suínos.

A vacinação parece ser a forma mais efetiva de controlar a PES, conforme citado por Kavanagh, N.T. The effect of pulse medication with combination of tiamulin and oxytetracycline on the performance of fattening pigs in a herd infected with enzootic pneumonia. International Veterinary Journal, 47, p.58-61, 1994 e Lin J.H. et al., Protective effects of oral microencapsulated Mycoplasma hyopneumoniae vaccine prepared by co-spray drying method. Journal of Veterinary Medicine Science, 65, p.69-74, 2003, porém, como mencionado anteriormente, a produção de bacterinas contra esta enfermidade é muito dispendiosa e onerosa.

Além disso, este tipo de vacina não impede a colonização nem o estabelecimento de suínos portadores, uma vez que são praticamente incapazes de estimular uma adequada imunidade de mucosa, caracterizada pela produção de IgA secretora (IgAs). Nesse contexto são necessárias novas alternativas para o controle da PES. Uma das alternativas mais promissoras é a produção de vacinas através da tecnologia do DNA recombinante. A primeira etapa no desenvolvimento de uma vacina recombinante é a seleção de antígenos com potencial de estimular uma imunidade protetora.

O passo inicial de qualquer patógeno que invade o hospedeiro através das mucosas é a sua colonização. Zhang et al. (1995) identificaram e caracterizaram uma adesina de M. hyopneumoniae responsável pela ligação a receptores presentes nos cílios das células epiteliais da traquéia, brônquios e bronquíolos dos suínos. Esta adesina foi designada P97 e é um dos antígenos imunodominantes de M. hyopneumoniae , vide Zhang Q. et al., Identification and characterization of a Mycoplasma hyopneumoniae adhesin. Infection and Immunity, 63, p. 1013-1019, 1995.

Mais tarde, Hsu T. & Minion F.C Identification of the cilium binding epitope of the Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin. Infection and Immunity, 66, p.4762-4766, 1998 identificaram o epítopo da P97 responsável pela ligação ao cílio suíno, uma seqüência repetitiva de cinco aminoácidos (AAKPV/E) que é altamente imunogênica e que está localizada na porção C terminal da proteína, designada região R1. Soro suíno em fase convalescente reconheceu a região R1 (Minion F.C. et al., R1 region of P97 mediates adherence of Mycoplasma hyopneumoniae to swine cilia. Infection and Immunity, 68, p.3056-3060, 2000, demonstrando o potencial imunogênico deste antígeno.

O anticorpo monoclonal (MAb) F1B6 reconheceu a região R1 da P97 em um Western blot (Hsu T. et al., Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae. Journal of Bacteriology, 179, p. 1317-1323, 1997 e foi capaz de bloquear a aderência de M. hyopneumoniae ao cílio suíno em um teste de inibição da aderência “in vitro” Zhang Q. et al., Identification and characterization of a Mycoplasma hyopneumoniae adhesin. Infection and Immunity, 63, p. 1013-1019, 1995, sugerindo que esta região da adesina possui papel fundamental na patogenia da PES, tornando-a uma forte candidata a antígeno vacinai. Em adição, o gene que codifica a P97 já foi clonado e seqüenciado (Hsu T. et al., Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae. Journal of Bacteriology, 179, p. 1317-1323, 1997.

Uma vez selecionado o antígeno de interesse para a produção de uma vacina de subunidade recombinante contra a PES (região R1 da adesina P97), torna-se indispensável também a seleção de um adjuvante imunológico, uma vez que este tipo de vacina normalmente apresenta pobre imunogenicidade. Além disso, vacinas de subunidade geralmente não estimulam uma adequada imunidade de mucosa (Rigano, M.M. et al., Targeting of plant-derived vaccine antigens to immunoresponsive mucosal sites. Vaccine, 21, p.809-811, 2003;

Thaker E.L. et al. Evaluation of local and systemic immune responses induced by intramuscular injection of a Mycoplasma hyopneumoniae bacterin to pigs. American Journal of Veterinary Research, 61, p.1384-1389, 2000 e Lin J.H. et al. Protective effects of oral microencapsuled Mycoplasma hyopneumoniae vaccine prepared by co-spray drying method. Journal of Veterinary Medicine Science, 65, p.69-74, 2003 sugeriram que anticorpos de mucosa são importantes para o controle da PES. Devido à maioria das infecções começarem pelas mucosas, a imunização via mucosa é uma estratégia atrativa para o bloqueio dos patógenos no ponto de entrada. Já está bem estabelecido que o sucesso da imunização de mucosa requer que o antígeno seja administrado via mucosa, entretanto antígenos administrados por esta via são freqüentemente não imunogênicos e podem induzir tolerância imunológica. Uma alternativa para os problemas mencionados acima é a utilização de adjuvantes de mucosa.

Uma nova classe de adjuvantes vem ganhando destaque na produção de vacinas de subunidade. Esta classe é representada pela subunidade B da enterotoxina termolábil de Vibrio cholerae e Escherichia coli (CTB e LTB, respectivamente). Estas subunidades atóxicas apresentam aproximadamente 80% de homologia e são potentes adjuvantes de mucosa, estimulando uma forte resposta sistêmica e secretória (IgAs) de anticorpos contra antígenos co-administrados ou acoplados, vide o artigo por Verweij W.R. et al., Mucosal immunoadjuvant activity of recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit: Induction of systemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with influenza virus surface antigen. Vaccine, 16, p.3476-3482, 1998.

Um estudo com CTB e LTB recombinante demonstrou o potencial imunomodulador desses peptídeos, sendo que a LTB apresentou efeito adjuvante de mucosa mais potente que a CTB (Millar D.G. et al., Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit is a more potent mucosal adjuvant than its closely related homologue, the B subunit of cholera toxin. Infection and Immunity, 69, p.3476-3482, 2001. Antígenos podem ser conjugados a LTB através de fusão genética ou conjugação química. Imunidade protetora em camundongos, contra o vírus sincicial respiratório, citado em Oien N.L et al., Induction of local and systemic immunity against human respiratory syncytial virus using a chimeric FG glycoprotein and cholera toxin B subunit. Vaccine, 12, p.731-735, 1994, herpes vírus tipo 1, conforme o artigo por Richards C.M. et al., Protective immunity to ocular herpes simplex virus type-1 infection in mice using Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Journal of Virology, 75, p. 1664-1671, 2001, Streptococcus do grupo A, vide o artigo por Dale J.B. et al., Intranasal immunization with recombinant group a streptococcal M protein fragment fused to the B subunit of Escherichia coli labile toxin protects mice against systemic challenge infections. Journal Infectious Diseases, 171, p. 1038-1041, 1995 e Helicobacter pyloh (citado por Weltzin R. et al., Parenteral adjuvant activities of Escherichia coli heat-labile toxin and its B subunit for immunization of mice against Helicobacter pylori infection. Infection and Immunity, 68, p.2775-2782, 2000, foi reportada utilizando rLTB ou rCTB como adjuvante de mucosa.

A literatura de patentes apresenta vários documentos sobre vacinas contra

PES.

A patente US 4.894.332 trata de antígenos de superfície de micoplasma suíno, esses antígenos sendo preparados por técnicas de DNA recombinante. É descrita uma vacina para o micoplasma suíno baseada nesses antígenos e métodos de tratamento para prevenir a pneumonia enzoótica usando a dita vacina. Seqüências de DNA que codificam para esses antígenos são também descritas.

A patente US 5.252.328 trata de uma composição para proteger suínos contra a pneumonia micoplásmica causada por M. hyopneumoniae, que inclui pelo menos uma proteína que é um antígeno de M. hyopneumoniae. O antígeno de M. hyopneumoniae está presente em uma proporção efetiva para a proteção de suínos contra a pneumonia micoplásmica causada por M. hyopneumoniae. Um antígeno preferido é o antígeno de M. hyopneumoniae de peso molecular 74,5 kDa.

A patente US 6.162.435 trata da proteína P102 purificada ou isolada de Mycoplasma hyopneumoniae preparada por meios recombinantes ou sintéticos, e polipeptídeos ou peptídeos que são partes de P102 e que quando administrados a um porco suscitam a formação de anticorpos que se ligam a Mhyo. A seqüência de aminoácidos preferida está ilustrada na figura 1 dessa publicação norte-americana. Também são providas moléculas de DNA recombinante úteis na preparação de P102 e dos peptídeos mencionados.

A patente US 6.846.477 trata de uma vacina em dose única para Mycoplasma hyopneumoniae onde a vacina compreende uma preparação de célula inteira ou parcial inativada de Mycoplasma hyopneumoniae que contém pelo menos 1,108 unidades de mudança de cor (CCU). A vacina pode ser também uma preparação viva modificada, uma vacina de subunidade ou uma vacina de ácido nucléico ou de DNA. A vacina compreende adicionalmente um adjuvante como géis minerais ou tensoativos como lisolecitina.

A publicação EP 1546357 trata de materiais e métodos para proteger um animal como um porco, de pneumonia enzoótica. A invenção é baseada na descoberta de ácidos nucléicos de Mycoplasma hyopneumoniae que codificam polipeptídeos de superfície celular que podem ser usados para induzir uma resposta imuno protetora em um animal suscetível de pneumonia. A publicação provê polipeptídeos imunogênicos purificados para serem usados como antígenos para suscitar uma resposta imune em um porco. A invenção também provê ácidos nucléicos isolados que codificam estes polipeptídeos para gerar uma resposta imune em um animal. Os polipeptídeos purificados e ácidos nucléicos isolados podem ser combinados com carreadores aceitáveis para serem introduzidos em um animal.

Apesar dos desenvolvimentos da técnica, ainda há necessidade de uma vacina para a pneumonia enzoótica suína (PES) à base da proteína rLTBRI, dita proteína sendo composta pela fusão da subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) (dotada de atividade adjuvante) com a região repetitiva R1 (dotada de atividade imunogênica) da adesina P97 de Mycoplasma hyopneumoniae (R1) através da tecnologia do DNA recombinante, a dita vacina sendo utilizada na prevenção e controle da PES, o processo de preparação de dita vacina e aplicação da mesma via mucosa nasal, visando uma melhor estimulação do sistema imune da mucosa respiratória sendo descritos e reivindicados no presente pedido.