Proteínas liga e ligb (leptospiral ig-like(lig) domains) para vacinação e diagnóstico

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0505529-6 A2
  • Data do depósito:
  • 19/12/2005
  • Data da publicação:
  • 25/09/2007
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/53
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos;
    ;
    C12N 15/31
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas microbianas, p. ex. enterotoxinas;
    ;
    A61K 39/02
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos;
    ;

Proteínas LigA e LigB (Leptospiral Ig-like (Lig) domains) para vacinação e diagnóstico A presente invenção se refere a moléculas de DNA (ácido dexoribonucleico) isoladas que codificam para as proteínas LigA e LigB. A invenção se refere ainda ao uso de fragmentos dessas proteínas no diagnóstico, e na formulação de vacinas para a prevenção de infecções causadas por Leptospira em humanos e animais.

Página de 11

Documento

Proteínas LigA e LigB (Leptospiral Ig-like (Lig) domains) para vacinação e diagnóstico Campo da Invenção

A presente invenção se refere a moléculas de DNA 5 (ácido dexoribonucleico) isoladas que codificam para as proteinas LigA e LigB. A invenção se refere ainda ao uso de fragmentos dessas proteinas no diagnóstico, e na formulação de vacinas para a prevenção de infecções causadas por Leptospira em humanos e animais.

10 ' Fundamentos da Invenção

A leptospirose é uma zoonose causada pela bactéria Leptospira spp. patogênicas, capazes de afetar diferentes espécies animais, inclusive o homem. Os roedores (ratos e camundongos) são    os    principais    transmissores    de

15 leptospirose, embora qualquer animal infectado possa transmitir a doença. Cães, gatos, bovinos e suinos são apenas alguns exemplos.

As leptospiras são espiroquetas aeróbicas que se dividem em duas espécies:    L. interrogans e L. biflexa. 0

20 complexo interrogans contém mais de 200 sorovares agrupados em 25 sorogrupos. Quatro desses sorovares são responsáveis pela maioria dos casos de doença no homem, quais sejam; L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L. pomona e L. autumnalis.

25    A infecção humana causada pela leptospira resulta da

exposição direta ou indireta à urina de animais infectados. Há outras modalidades menos importantes de transmissão como a manipulação de tecidos animais e a ingestão de água e alimentos contaminados. A penetração do microorganismo leptospira se dá pela pele lesada ou pelas mucosas da boca, narinas e olhos, podendo ocorrer através da pele íntegra, quando imersa em água por longo período.

A leptospirose é caracterizada por amplo espectro de manifestações clínicas, variando desde uma infecção não aparente até uma doença fulminante e fatal. A leptospirose é tipicamente uma doença bifásica. Na fase leptospirêmica ou septicêmica, que dura de quatro a nove dias, os sintomas iniciais são cefaléia, geralmente frontal, mialgia mais intensa nos músculos das panturrilhas e regiões lombares, hipertermia de 39°C com calafrios, anorexia, náuseas e vômitos. Na segunda fase ou fase imune surgem anticorpos do tipo imunoglobulinas M (IgM), que determinam a formação de imunocomplexos circulantes que podem causar meningite, uveíte e colapso circulatório, entre outros distúrbios. A duração e as manifestações clínicas dessa fase são muito variáveis.

A confirmação diagnostica da leptospirose é feita pela pesquisa direta dos microrganismos no sangue ou urina (leptospiremia e leptospirúria), por testes sorológicos e pelo isolamento do microrganismo em animal inoculado. A soroaglutinação macroscópica (estudo que envolve IgM) e a soroaglutinação microscópica (estudo que envolve IgG) são fundamentais para o diagnóstico da enfermidade.

Todavia, o controle da leptospirose humana e animal é dificultado pela atual falta de ferramentas adequadas de diagnóstico. O teste sorológico padrão, conhecido como teste de soroaglutinação microscópica (MAT), é inadequado para identificação rápida já que esse teste só pode ser

!


desenvolvido em poucos laboratórios de referência e exige análise de soros pareados para alcançar suficiente sensibilidade. A dependência dos resultados do teste MAT acarreta atrasos no estabelecimento da causa do surto em 5 diversos casos. Foram desenvolvidos teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - Ensaio de Imunoadsorção Ligado à Enzima) e outros testes sorológicos rápidos baseados nas preparações de antígenos de leptospira com células inteiras para uso como um método alternativo para classificar a 10 infecção por leptospira, embora seja ainda necessário realizar o teste MAT para confirmação do caso. Existem relatados de ensaios de diagnóstico por reação em cadeia de polimerase (PCR), baseado em PCR em tempo real, os quais podem diferenciar entre espécies de leptospira patogênicas 15 e saprofiticas, porém esses testes ainda não foram totalmente avaliados. Testes    sorológicos baseados em

antigenos    recombinantes são    amplamente    usados para

classificar infecções causadas por espiroquetas tais como doença de Lyme e sifilis, porém o uso de proteínas 20 recombinantes para sorodiagnóstico de leptospirose não foi amplamente investigado. É conhecido a partir do estado da técnica um ensaio de imuno-captura de antígeno flagelar recombinante para sorodiagnóstico de leptospirose bovina [Bughio, N.I., M.    Lin, and O.P. Surujballi, Use of

25 recombinant flagellin protein as a tracer antigen in a fluorescence polarization assay for diagnosis of leptospirosis. Clin Diagn Lab Immunol, 1999. 6(4): p. 599-605] . Uma proteína recombinante de choque térmico, a Hsp58, mostrou um alto grau de reatividade para ELISA com amostras de soro de um pequeno número de casos de leptospirose em humanos [Park, S.H., B.Y. Ahn, and M.J. Kim, Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune response. DNA Cell Biol, 1999. 18(12): p. 903-10] . Também é conhecido o uso de testes ELISA baseados na proteína LipL32 e GroEL. Todavia, os resultados usando proteínas recombinantes não são encorajadores [Flannery, B., et al., Evaluation of recombinant Leptospira antigen-based enzyme-linked immvnosorbent assays for the serodiagnosis of leptospirosis. J Clin Microbiol, 2001. 39(9): p. 3303-3310].

Além disso, não existem mecanismos eficazes para controle e prevenção de leptospirose. 0 controle ambiental é de difícil implementação devido ao longo tempo de sobrevivência de leptospiras patogênicas no solo e na água. Os esforços atuais são direcionados para a imunização protetora como um mecanismo eficaz contra a leptospirose. As vacinas atualmente disponíveis são baseadas em célula inteira ou em preparações de membrana de leptospiras patogênicas [Martinez, R., et al., Efficacy and safety of a vaccine against human leptospirosis in Cuba [in Spanish]. Rev Panam Salud Publica, 2004. 15(4): p. 249-55] [Yan, Y., et    al., An evaluation of the serological    and

epidemiological effects of the outer envelope vaccine to leptospira. J Chin Med Assoe, 2003. 66(4): p. 224-30] que aparentemente induzem respostas protetoras, através da indução de anticorpos contra lipopolissacarideo [Faine,

S.B., et al., Leptospira and leptospirosis. 2nd ed. 1999, Melbourne, Australia: MediSci]. Todavia, essas vacinas não induzem proteção prolongada contra a infecção. Além disso, essas vacinas não proporcionam imunidade protetora cruzada 5 contra sorovares que não estão incluidos na formulação da vacina [Rodriguez, A.G., et al., [Microbiological characterization of candidate vaccine strains of Ballum serogroup Leptospira interrogans]. Rev Cubana Med Trop, 2003.    55(3):    p. 146-52].    0 grande número de sorovares

10 patogênicos (>250) e o alto custo para produzir uma vacina multi-sorovar têm sido as maiores limitações no desenvolvimento de vacinas eficazes através de estratégias baseadas em célula inteira ou em preparações de membrana.

O mecanismo de patogênese na leptospirose, bem como em 15 doenças causadas por outros espiroquetas, tais como doença de Lyme e sifilis, depende da capacidade de disseminação do patógeno dentro do hospedeiro durante o estágio inicial da infecção. Acredita-se que as proteinas de leptospira associadas às membranas mediam interações que permitem 20 entrada e disseminação através dos tecidos do hospedeiro. Potenciais fatores de virulência associados à superficie servem como candidatos para estratégias vacinais que induzem respostas a esses fatores, que bloqueiam a disseminação no hospedeiro. Além disso, as proteinas 25 associadas à membrana seriam acessíveis à resposta imune durante a infecção do hospedeiro e, assim, constituem alvos

para imune

proteção

através de

mecanismos

tais

como

fagocitose

dependente

de

anticorpo

e morte

mediada

por

complemento.

A produção

desses

antigenos-

■alvos

como

proteínas recombinantes oferece uma estratégia de custo efetivo para imunização protetora para a leptospirose como uma vacina a base de sub-unidades.

Em adição, a seleção de alvos associados à superfície 5 que são conservados dentre as leptospiras patogênicas, pode evitar as limitações encontradas com as formulações de vacina de célula inteira atualmente disponíveis.

A maior limitação no campo da leptospirose tem sido identificar proteínas associadas à superfície e proteínas 10 expressas em hospedeiro através de métodos convencionais

bioquímicos e métodos moleculares. A partir da seqüência    ( ça

genômica da    espiroqueta, Borrelia burgdorferi, foram

identificadas mais de 100 lipoproteinas associadas à superfície. Os genomas L. interrogans dos sorovares Lai e 15 Copenhageni de foram recentemente seqüenciados pela China e Brasil [Nascimento, A.L., et al., Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. J Bacteriol, 2004.

186(7):    p. 2164-72] [Ren, S.X., et al., Unique

20    physiological    and pathogenic features    of Leptospira

interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature,

2003. 422(6934): p. 888-93]. Com base nas seqüências codificantes previstas analisadas para dominios expostos de superfícies, a leptospira possui mais de 260 proteínas 25    associadas à    superfície [Nascimento,    A.L., et al.,

Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. J Bacteriol, 2004. 186(7): p. 2164-72]. Até o momento, foram caracterizadas    16 proteínas associadas    à superfície,

através de isolamento de extratos de membrana, purificação e caracterização de proteinas nesses extratos e clonagem desses alvos de proteina [Matsunaga, J., et al., Pathogenic Leptospira species express surface-exposed proteins 5 belonging to the bacterial immunoglobulin superfamily. Mol Microbiol, 2003. 49(4): p. 929-45], [Cullen, P.A., et al., LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun, 2003. 71(5): p. 2414-21], [Haake, D.A. and J. Matsunaga, Characterization of the 10 leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun, 2002.    70(9):

c. '

p. 4936-4945.] e [Haake, D.A., et al., Leptospiral outer membrane proteins OmpLl and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infect Immun, 1999. 67(12): p. 6572-82]. 15    Imunização com proteinas recombinantes, para diversos

alvos identificados, LipL32, OmpLl e LipL41, induziu uma resposta protetora parcial. [Haake, D.A., et al., Leptospiral outer membrane proteins OmpLl and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infect Immun, 1999. 20    67(12): p. 6572-82], [Haake, D.A., et al., The leptospiral

major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun, 2000. 68(4): p. 2276-85], [Branger, C., et al., Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective 25 immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination. Infect Immun, 2001.    69(11): p. 6831-6838] e

[Branger, C.f et al., Protection against Leptospira interrogans Sensu Lato Challenge by DMA Immunization with the Gene Encoding Hemolysin-Associated Protein 1. Infect Immun, 2005. 73(7): p. 4062-4069].

Proteínas de LigA-m e LigB-m, obtidas a partir de L. interrogans, sorovar Manilae (UP-MMC-NID) induziram uma 5 resposta imune protetora completa no modelo de camundongo com leptospirose letal [Koizumi, N. and H. Watanabe, Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity. Vaccine, 2004. 22(11-12): p. 1545-52]. Todavia, esse modelo não é ideal tendo em vista a necessidade de um 10 grande número de leptospiras para causar a infecção letal, além do que a linhagem de camundongo usada era um mutante (C3H/HeJ) para TLR4.

Além da literatura acima discutida, citam-se ainda os documentos W003/098214,    publicado em 27/11/2003,    de

15 titularidade de Fundação Oswaldo Cruz e o documento WO2004/032599, publicado em 22/04/2004 de titularidade Cornell Research Foundation Inc. Ambos os pedidos de patente reivindicam as proteínas Lig para uso em diagnóstico e vacina, porém nenhum dos documentos apresenta 20 evidência de proteção usando as proteínas Lig. Adicionalmente, esses documentos    não    se    referem a

fragmentos de proteínas Lig, nem tão pouco apresentam as seqüências desses fragmentos para uso no diagnóstico, bem como em uma formulação de vacina no combate à leptospirose. 25 Sumário da Invenção

Um primeiro objetivo da presente invenção trata de moléculas de DNA de Leptospira spp e polipeptídeos codificados por essas moléculas, ambos possuindo domínios repetitivos de Leptospiral immunoglobulin-like (Lig).

Ainda um outro objetivo da presente invenção se refere ao uso isolado ou combinado dos polipeptideos derivados de LigA e de LigB, dos anticorpos para esses polipeptideos e dos polinucleotideos que codificam para LigA e LigB, com 5 veiculos farmaceuticamente aceitáveis para tratar ou prevenir a infecção com Leptospira.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um kit para diagnóstico de Leptospira spp baseados em fragmentos recombinantes das proteinas LigA e LigB.

10 Descrição das Figuras

A    Figura    1    mostra    o esquema dos genes Ligs e a

estratégia de clonagem.

A Figura 2 mostra os polipeptideos da proteina Lig recombinante (rLig) purificada.

15    A Figura 3A mostra uma avaliação em ELISA da imune

resposta em hamsters imunizados com polipeptideos LigA.

A    Figura    3B    mostra    uma    avaliação    em    ELISA    da    imune

resposta em hamsters imunizados com polipeptideos LigB.

A    Figura    3C    mostra    uma    avaliação    em    ELISA    da    imune

20 resposta em hamsters imunizados com polipeptideos LigA.

A    Figura    3D    mostra    uma    avaliação    em    ELISA    da    imune

resposta em hamsters imunizados com polipeptideos LigB.

A Figura 4 mostra a reação dos soros dos pacientes com os polipeptideos da proteina Lig recombinante (rLig).

25 Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

A presente invenção descreve duas moléculas de DNA, derivadas de L. interrogans, que codificam as proteinas, aqui designadas de LigA e LigB que possuem alto peso

molecular, respectivamente de 128 e 220 kDa, peso molecular esse baseado na seqüência de aminoácido dos polipeptideos.

As duas proteínas da presente invenção possuem 12 ou 13 seqüências repetidas em tandem (em série) de 5 aproximadamente 90 aminoácidos. As seqüências repetidas da LigA e LigB são altamente conservadas, ou seja possuem uma identidade entre elas de >90% da seqüência de aminoácido, e pertencem à família das proteínas Bacterial immunoglobulin-like (Big). Essas regiões Big são encontradas em fatores de 10 virulência de outras bactérias patogênicas.

As moléculas de DNA da presente invenção que codificam para as proteínas de Leptospira com domínios de proteínas Lig, aqui denominadas "ligA" e "ligB", podem ser inseridas como DNA heterólogo em vetores de expressão para produzir 15 peptídeos e polipeptideos. Os polipeptideos recombinantes podem ser purificados a partir de hospedeiras de expressão intermediária ("surrogate hosts") transformados com esses vetores de expressão. Os polipeptideos derivados da LigA e LigB são marcadores sorológicos para infecção ativa e 20 passada, já que o soro de pacientes com leptospirose e o soro de animais infectados ou imunizados com Leptospira spp. reconhecem polipeptideos isolados das Lig.

Além disso, os polipeptideos das LigA e LigB derivados de preparações de antígeno recombinante ou nativo, são 25 imunogênicos. Os anticorpos obtidos a partir de animais experimentais imunizados com polipeptideos recombinantes purificados de LigA e LigB reconhecem o antígeno nativo de Leptospira spp., e são úteis para detectar espiroquetas

5


10


15


20


patogênicas em amostras obtidas de individuos com suspeita de infecção.

Também é importante salientar que os polipeptideos LigA e LigB da presente invenção induzem uma resposta imune contra espiroquetas patogênicas.

Os polipeptideos derivados de LigA e de LigB, os anticorpos para esses polipeptideos e os polinucleotideos que codificam para LigA e LigB podem ser usados sozinhos ou combinados com veiculos farmaceuticamente aceitáveis para tratar ou prevenir a infecção com Leptospira. Tendo em vista que dominios Big estão presentes nas proteinas associadas com a virulência em outros patógenos bacterianos, essas regiões Big podem ser usadas para tratar ou prevenir infecções não relacionadas àquelas causadas por Leptospira spp.

As seqüências de polinucleotideos lig são listadas e analisadas através de programas de bioinformática (AlignX -Vector NTI V. 8, Invitrogen) para determinar o nivel de conservação dos polinucleotideos lig na Leptospira spp.

Uma modalidade da presente invenção identifica polinucleotideos lig e polipeptideos dos mesmos que são: (1) reconhecidos por soros de individuos infectados com a Leptospira patogênica; e, (2) capazes de estimular uma resposta imune em modelos de animais de laboratório. Além disso, é proporcionado um método para identificar polinucleotideos, usando programas de computador de bioinformática, com potencial para reconhecer soros de individuos infectados com Leptospira spp. ou outras bactérias patogênicas.

\\


Uma terceira modalidade da presente invenção é proporcionar composições farmacêuticas para induzir respostas imune protetoras em individuos para espiroquetas patogênicas, onde as ditas composições compreendem uma 5 quantidade (10 - lOOmcg) imunogenicamente efetiva de um ou mais dos antigenos selecionados dentre o grupo consistindo de polipeptideos    de LigA    e LigB com sequências

funcionalmente equivalentes e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Além disso,    é apresentado um método para

10 produzir um vetor de expressão contendo polinucleotideos ligA e ligB e obter polipeptideos substancialmente purificados derivados dessas seqüências de polinucleotideos de ligA e ligB.

Em uma quarta modalidade, a presente invenção 15 proporciona um método para identificar polipeptideos com seqüências funcionalmente equivalentes, que inclui as etapas de:    (a) incubar os componentes compreendendo o

composto e um polipeptideo de LigA ou LigB ou polipeptideos com seqüências funcionalmente equivalentes sob condições 20 suficientes para permitir que os componentes interajam; e, (b) medir a ligação do composto ao polipeptideo LigA ou LigB ou aos polipeptideos com seqüências funcionalmente equivalentes. Preferivelmente, o método é baseado em sorodiagnóstico utilizando soro de um individuo com 25 suspeita de infecção passada ou infecção ativa por Leptospira spp ou outros patógenos bacterianos relacionados.

Em uma quinta modalidade, a invenção proporciona um método para detectar patógenos em uma amostra que inclui

contato da amostra suspeita de conter uma espiroqueta patogênica com um reagente que se liga ao componente celular especifico do patógeno e detectar a ligação do

reagente ao componente. Em um aspecto especifico do método,

C

5 o reagente que se liga ao componente especifico do patógeno é um oligonucletideo para a identificação polinucleotideos de ligA e ligB. Ainda em outro aspecto especifico do método, o reagente que se liga ao componente especifico do patógeno é um anticorpo contra o polipeptideo de LigA oü5, 10 LigB ou polipeptideos com seqüências funcionalmente equivalentes.

Em uma sexta modalidade da presente invenção, é proporcionado um kit útil para detecção de:    (i)

polipeptideo de LigA e LigB ou polipeptideos com seqüências 15 funcionalmente equivalentes; (ii) polinucleotideos de ligA e ligB; ou, (iii) anticorpos que se ligam a polipeptideos de LigA    ou LigB ou polipeptideos com seqüências

funcionalmente equivalentes.

A invenção será agora descrita com referência aos 20 exemplos,    os quais não devem ser considerados como

limitativos da mesma.