Uso de compostos obtidos a partir de extratos da arrabidaea brachypoda como antiulcerogênico

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 031926 0 A2
  • Data do depósito:
  • 12/12/2013
  • Data da publicação:
  • 06/10/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 17/02
    F?rmacos para o tratamento de problemas dermatol?gicos; / para tratamento de feridas, ?lceras, queimaduras, cicatrizes, queloides ou similares;
    ;
    A61K 31/352
    Prepara??es medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos; / Compostos heteroc?clicos; / tendo oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel, p. ex. fungicromina; / tendo an?is de seis membros com um oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel; / condensado com an?is carboc?clicos, p. ex. canabin?is, metantelina;
    ;

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIULCEROGÊNICO. Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir do extrato de raí­zes, caules, cascas e folhas de espécies vegetais do gênero Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, para tratar doenças ulcerogênicas.

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Documento

Exemplos da invenção:

A seguir, são apresentados exemplos expositivos de realizações particulares da presente invenção, sem criar quaisquer limitações ao seu escopo.

1    - Obtenção do extrato hidroalcoólico de Arrabidaea

brachypoda:

Numa cuba de um extrator dotado de agitação mecânica, adiciona-se 1,5 kg de raizes, caules ou folhas de plantas do gênero Arrabidaea, tais como a Arrabidaea brachypoda, secas em estufas com temperatura controlada a 60 °C.

O material é pulverizado e congelado em nitrogênio liquido e, posteriormente, triturado em moinho elétrico.

Em seguida, adiciona-se 9,0 L de etanol 70% (v/v), com agitação frequente, pelo periodo de 150 horas.

A dorna de extração é aquecida gradativamente, em uma velocidade de aquecimento de 10 °C por minuto, até que se atinja uma temperatura entre 45 e 50 °C. Em seguida, o extrato é filtrado a quente, em uma temperatura que varia de 35 a 40 °C a vácuo, através de filtros de 100 a 150 mm.

Após evaporação do solvente em evaporador rotativo com pressão reduzida e temperatura máxima de 40 °C, obtém-se cerca de 20 g de um extrato hidroalcoólico concentrado.

2    - Obtenção da partição diclorometano de Arrabidaea brachypoda:

Cerca de 8,0 g do extrato hidroalcoólico é dissolvido em 500 mL de solução de água/metanol 8:2 e 250 mL de diclorometano a uma temperatura que varia de 20 a 25 °C.

A solução é adicionada a um balão de separação e, após a agitação, aguarda-se a separação das fases ao abrigo da luz. A fase diclorometânica é retirada e adiciona-se mais 250 mL de diclorometano, repetindo-se as etapas de agitação e separação de fases ao abrigo da luz.

O processo é repetido até a exaustão, ou seja, até que a fase diclorometânica não apresente mais coloração ao ser misturada com a fase aquosa. A fase diclorometânica é rotaevaporada, apresentando um rendimento de 31,2%.

3    - Obtenção dos compostos ativos a partir da purificação do extrato de Arrabidaea brachypoda:

Após obtenção do extrato hidroalcoólico (conforme exemplificado em 1) e obtenção da partição diclorometano (conforme exemplificado em 2), uma fase diclorometânica apresentando um rendimento de 33,7% é obtida.

O extrato diclorometânico assim obtido é purificado por cromatografia liquida a média pressão (CLMP) utilizando sistema eluente composto por uma mistura de metanol e água

em modo gradiente (5    % a 100    % em 72 horas) e uma fase

estacionária a fase inversa (C-18 e 15-25 [im) em uma coluna de 460 mm de largura por 70 mm de diâmetro.

Os compostos foram detectados por ultravioleta a 254 nm. As frações obtidas são submetidas a diversas técnicas cromatográficas, de modo a isolar os compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03.

Avaliação da atividade gastroprotetora:

Para efeito comparativo, as drogas utilizadas para a determinação da atividade antiulcerogênica dos compostos obtidos a partir da Arrabidaea brachypoda foram:

-    lansoprazol;

-    carbenoxolona;

-    indometacina;

-    cimetidina.

Todas as drogas foram preparadas imediatamente antes da administração em solução salina com concentração de 0,09%.

Os animais utilizados eram ratos machos unib-WH, com massa entre 150 e 250 gramas. Os animais foram aclimatados às condições do laboratório por pelo menos sete dias antes da manipulação experimental, com temperatura (23 ± 2 °C) e ciclos claro-escuro de 12 horas controlados. Ainda, os mesmos foram alimentados com ração e água ad libitum e distribuídos ao acaso nos diferentes grupos experimentais, sendo submetidos a jejum (com água ad libitum) de pelo menos 12 horas, dependendo do tipo de experimento.

-    Envolvimento do NO na gastroproteção (técnica desenvolvida por Sikiríc et ai. em 1997):

Os ratos submetidos a jejum por 24 horas foram

divididos em grupos de acordo com os tratamentos.

O grupo controle recebeu injeção peritoneal de solução salina ou a administração de L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster), um inibidor da NO-sintase pela mesma via (10 mg/kg).

Após 30 min, os grupos receberam (i) veiculo (salina), (ii) extrato de Arrabídaea brachypoda e (iii) carbenoxolona (controle positivo) por via oral.

Posteriormente, decorridos 50 minutos da administração dos pré-tratamentos, os animais receberam oralmente etanol absoluto. Os animais foram sacrificados após 1 hora e os estômagos foram removidos e abertos na grande curvatura para determinação da área das lesões.

-    Envolvimento de grupamentos sulfidrila na gastroproteção (técnica desenvolvida por Matsuda et ai. Em 1999) :

Após jejum de 24 horas, os animais foram divididos ao acaso em grupos, tratados com uma injeção subcutânea de solução salina (controle negativo) ou 10 mg/kg de N-etilmaleimida (NEM), um bloqueador dos grupos sulfidrilas.

Após 30 min do pré-tratamento, os grupos receberam veiculo (10 mL/kg), carbenoxolona (controle positivo) e extrato de A. brachypoda (300 mg/kg) por via oral.

Trinta minutos após o tratamento, todos os grupos de animais receberam etanol absoluto por via oral. Uma hora depois, os animais foram sacrificados e seus estômagos foram removidos e abertos ao longo da grande curvatura para determinação da área das lesões.

-    Determinação dos níveis de PGE2 (técnica desenvolvida por Curtis et ai. em 1995):

O tecido dos animais submetidos à úlcera induzida por DAINES foi homogeneizado e preparado conforme metodologia conhecida, procedendo-se à sensibilização e leitura por ELISA.

Dosagens em tecido de animais submetidos à úlcera induzida por etanol:

- Determinação dos níveis de glutationa (GSH):

Para efetuar a determinação do conteúdo de glutationa total, usou-se o método descrito por Anderson em 1985, que se baseia na oxidação total da glutationa reduzida (GSH) presente em uma amostra à sua forma oxidada (GSSG) , por meio da incubação da amostra com o ácido ditiobisnitro benzóico (DTNB).

O DTNB reduzido adquire uma coloração amarelada, que pode ser determinada espectrofotometricamente. O GSSG gerado é reduzido por ação da enzima glutationa redutase na presença de NADPH.

O GSH formado se oxida novamente, gerando um ciclo continuo, no qual a velocidade de redução do DTNB (e o seu consequente aumento de absorbância a 412 nm) é proporcional à quantidade total de glutationa (GSH+GSSG).

Para efetuar a determinação do conteúdo de glutationa total, foram utilizados os extratos citosólicos obtidos dos estômagos dos animais do experimento de úlcera induzida por etanol.

As amostras, após descongelamento, tiveram 20 pL do seu volume retirado e pipetado em uma placa de 96 canais, onde se adicionam 140 pL de NADPH, 5 pL de PBS e 20 pL DTNB.

A placa foi disposta no leitor do espectrofotômetro, onde permaneceu incubada por 5 minutos em uma temperatura de 30°C.

Após este periodo, foram adicionados 15pL de glutationa redutase e registrou-se o aumento de absorbância a 412 nm. Os resultados foram expressos como nmol/g de tecido.

- Determinação da atividade da glutationa redutase

(GR) :

Para a determinação

da atividade

da

GR, a

reação

enzimática foi preparada

com 100 pL

da

amostra

(após

centrifugação e diluição do sobrenadante em tampão fosfato pH = 7,4, na relação 1:10) e 150 pL da mistura formada por EDTA (0,20 mM) , glutationa oxidada (1 mM) e NADPH (0,1 mM) . A absorbância foi lida a 365 nm, entre 0 e 10 min, conforme técnica desenvolvida por Carlberg & Mannervik, 1985.

-    Determinação da atividade da glutationa peroxidase (GPx):

As amostras foram centrifugadas a 12000 rpm, a 4 °C, por 15 min e o sobrenadante foi diluido em tampão fosfato 0,1 M (pH = 7,4) na proporção 1:10.

A uma aliquota de 100 pL do raspado, foram adicionados 150 pL de solução de glutationa reduzida (10 mM), NADPH (4 mM) e glutationa redutase (1U) e 20 pL de H2C>2 (25 mM) , de acordo com método desenvolvido por Yoshikawa et al. em 1993. A absorbância foi determinada a 365 nm, entre 0 e 10 min.

-    Avaliação do efeito cicatrizante de úlcera induzida por ácido acético (técnica desenvolvida por Takagi et al. em 1969) :

Os ratos foram anestesiados com cloridrato de xilazina e cetamina para a realização de uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifoide.

A parede anterior do estômago foi exposta e uma área da serosa foi delimitada com um anel plástico sobre a qual se adicionou 50 pL de ácido acético P.A. com auxilio de uma micropipeta automática, sendo mantido o contato entre o ácido e a serosa durante 60 segundos.

Em seguida, a área foi limpa com solução salina e os animais tiveram suas cavidades abdominais fechadas, sendo mantidos em repouso até completa recuperação da anestesia para, então, serem acondicionados no biotério.

Depois de 48 horas do procedimento cirúrgico, iniciou-se a administração oral dos tratamentos (uma vez ao dia durante 7 e 14 dias) com o EAB (300 mg/Kg), lansoprazol (30 mg/kg - controle positivo) e veiculo (solução salina 0.9% -controle negativo).

Os animais foram pesados e observados desde a indução das lesões até o final dos tratamentos. Ao final deste periodo, os animais foram sacrificados, seus estômagos foram removidos e abertos no sentido da maior curvatura para determinação da área da lesão ulcerativa.

Também foram coletadas seções de tecido para confecção de lâminas histológicas. Os animais também tiveram coração, pulmões, figado, rins e testiculos coletados e pesados para verificação de possiveis sinais de toxicidade.

- Expressão das proteínas COX-1, COX-2 e EGF:

O homogenato gástrico foi centrifugado a 12000 rpm, a 4 °C, por 15 minutos. Valores determinados de proteina (50 gg) foram aplicados em gel de poliacrilamida e submetidos à eletroforese, com solução tampão. O gel foi submetido a

120V durante todo o processo.

Em seguida, as proteínas separadas no SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, em equipamento de eletrotransferência, com as membranas embebidas em tampão de transferência, mantidas em voltagem constante de 25 V, corrente de 1,0 A por 12 minutos.

As membranas de nitrocelulose contendo as proteínas transferidas foram incubadas em solução bloqueadora por uma hora para diminuir a ligação inespecífica de proteínas.

Em seguida, as membranas foram submetidas a sucessivas lavagens com tampão, em intervalos de 5 minutos. A membrana foi incubada a 4 °C durante uma noite, usando anticorpo específico para COX-1, COX-2 e EGF.

Após esse procedimento, a membrana de nitrocelulose foi novamente submetida a sucessivas lavagens com tampão, sendo, em seguida, incubada à temperatura ambiente por 1 h com anticorpo secundário para COX-1, COX-2 e EGF.

Para detectar as bandas imunoreativas, as membranas foram embebidas com solução de quimioluminescência por 5 minutos. Após esse período, as membranas foram colocadas em fotodocumentador para detecção das bandas fluorescentes e posterior análise densitométrica com auxílio do software específico.

-    Determinação da atividade da MPO:

Por se tratar de um importante indicador inflamatório, verificou-se, ainda, a atividade da MPO no modelo de úlcera crônica.

-    Preparação de lâminas histológicas:

Os cortes e lâminas histológicas foram preparados por fixação do material em ALFAC (formalina, álcool 80% e ácido acético) por 24 horas. As peças foram então desidratadas e incluídas em meio sólido apropriado.

Posteriormente, os blocos do meio foram cortados (7 pm de espessura) em micrótomo, de maneira seriada. As amostras foram submetidas à coloração por hematoxilina-eosina (HE) para observação geral da estrutura e celularidade em microscopia de luz.

-    Análise estatística:

Todos os resultados foram tratados estatisticamente e expressos como média ± desvio ou erro padrão e submetidos à análise de variância de uma via e, posteriormente, teste de Dunnett e/ou Tuckey com um nível de significância mínimo de *P < 0,05.

-    Úlcera gástrica induzida por etanol (técnica desenvolvida por Morimoto et al. em 1991):

Ratos unib-WH foram submetidos a jejum de 24 h com água ad libitum. No dia do experimento, eles foram divididos em 7 grupos:    salina como controle negativo,

lansoprazol como controle positivo e quatro grupos com o

extrato das

raízes

da

A.

brachypoda em diferentes

concentrações

(doses

de

10,

30, 100 e 300 mg. Kg”1)

dissolvido em salina em concentrações de 10 mL.Kg”1.

Os animais receberam o tratamento previsto para cada grupo e, uma hora depois, foi administrado 1 mL de etanol absoluto por via oral.

Após uma hora da indução da úlcera, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus estômagos retirados para quantificação das lesões.

Calculadas as áreas das lesões, os estômagos foram homogeneizados, preparados os extratos citosólicos e membranados para a realização de ensaios bioquimicos.

-    Úlcera gástrica induzida por anti-inflamatório não esteroidal (AINE):

Os animais foram submetidos a jejum de 24 horas com água ad libitum. No dia do experimento, os animais foram divididos em cinco grupos:    SHAM, salina, carbenoxolona,

tratamento com o extrato da planta A. brachypoda que será submetido à administração de indometacina e tratamento com o extrato da planta em que a indometacina não será administrada, para posterior avaliação dos niveis de prostaglandina E2.

Os grupos receberam os respectivos tratamentos via oral e, após 30 minutos, foi administrado o agente lesivo, indometacina (50 mg.Kg”1 solubilizada em carbonato de sódio 0,5%) em todos os grupos, menos no grupo SHAM e no que recebeu tratamento com a planta apenas para a verificação da PGE.