Uso de compostos obtidos a partir de extratos da arrabidaea brachypoda como antiulcerogênico

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 031926 0 A2
  • Data do depósito:
  • 12/12/2013
  • Data da publicação:
  • 06/10/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 17/02
    F?rmacos para o tratamento de problemas dermatol?gicos; / para tratamento de feridas, ?lceras, queimaduras, cicatrizes, queloides ou similares;
    ;
    A61K 31/352
    Prepara??es medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos; / Compostos heteroc?clicos; / tendo oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel, p. ex. fungicromina; / tendo an?is de seis membros com um oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel; / condensado com an?is carboc?clicos, p. ex. canabin?is, metantelina;
    ;

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIULCEROGÊNICO. Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir do extrato de raí­zes, caules, cascas e folhas de espécies vegetais do gênero Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, para tratar doenças ulcerogênicas.

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Documento

Transcorridas seis horas    da administração da

indometacina, todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram seus estômagos retirados para contagem das lesões. A porção glandular foi raspada e congelada a -80 °C para ensaios bioquimicos.

- Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico (técnica desenvolvida por Shay e Gruenstein em 194 6) :

Os ratos ficaram em jejum de 48 horas com água ad libitum. No dia do experimento, os animais foram divididos em quatro grupos: salina, lansoprazol, cimetidina e tratados com extrato da planta A. brachypoda.

Os ratos foram anestesiados e sofreram uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifoide para a amarradura do piloro.

A administração das drogas foi realizada logo após a amarradura, por via intraduodenal. As incisões foram suturadas e, após quatro horas da cirurgia, os ratos foram sacrificados. Os estômagos foram retirados cuidadosamente e a secreção ácida foi coletada. Após centrifugação, o volume e pH da secreção de cada animal foi medido.

- Determinação da produção de muco aderido à mucosa gástrica (técnica desenvolvida por Corne et al. em 1974):

Os ratos ficaram de jejum por 24 horas com água ad libitum para a realização do experimento. Os animais foram divididos em três grupos:    salina, carbenoxolona e extrato

da planta A. brachypoda.

Os grupos receberam os respectivos tratamentos por via oral e, transcorrida 1 hora, foi realizada a ligadura do piloro. Após quatro horas os animais foram sacrificados e os estômagos foram retirados e abertos no sentido da grande curvatura.

Os segmentos glandulares do estômago foram removidos e pesados e cada segmento foi transferido imediatamente para um tubo contendo agente corante. Após imersão por 2 horas nesta solução, o excesso de tinta foi removido por duas lavagens sucessivas com 10 mL de solução de sucrose 0.25 M, primeiro por 15 minutos e, então, por 45 minutos.

A tinta complexada com o muco da parede gástrica foi extraida com 10 mL de MgCl2 0,5 M por agitação intermitente por 1 minuto, a intervalos de 30 minutos, durante 2 horas.

Uma aliquota de 4 mL do extrato azul foi vigorosamente agitada com um volume igual de éter dietilico. A emulsão resultante foi centrifugada a 3600 rpm por 20 minutos e a absorvância da camada aquosa foi determinada a 580 nm.

A quantidade de corante extraida por grama de tecido glandular foi então calculada e expressa como concentração do corante em pg por mL de solução por grama de porção glandular.

- Atividade da mieloperoxídase (MPO) :

A atividade da mieloperoxidase foi determinada através do método descrito por Krawisz et al. em 1984. As amostras foram homogeneizadas em tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) a 0,5%    (p/v) em tampão

fosfato salina (50 mM, pH 6,0) com diluição final de 1:20 (p/v) até que a obtenção de um aspecto uniforme.

O HTAB atua como detergente, facilitando a liberação da enzima MPO dos grânulos de azurófilos dos neutrófilos, onde se encontra armazenada.

O homogenato foi submetido ao banho ultrassônico por 10 segundos, seguido de triplo processo de congelamento e descongelamento, que facilita a ruptura das estruturas celulares e, em consequência, a liberação da enzima.

A amostra foi centrifugada a 7000 G, durante 10 minutos e a atividade da MPO foi determinada seguindo a cinética da reação frente à água oxigenada.

Numa placa de ELISA, foram colocados 50 pL do sobrenadante e 150 pL de reativo de coloração e peróxido de hidrogênio (0,066%), em tampão fosfato (50mM, pH 6,0).

A absorbância foi determinada a 450 nm e a atividade da enzima foi calculada por interpolação em curva padrão, realizada com MPO procedente de neutrófilos humanos.

Uma unidade de MPO é definida como a quantidade necessária para degradar 1 mmol/minuto de peróxido de hidrogênio 25 °C. Os resultados foram expressos como U/g de proteina.

Resultados obtidos:

-    Envolvimento do NO na gastroproteção

A figura 1 mostra os dados obtidos na avaliação do envolvimento do NO na gastroproteção promovida pela A. brachypoda (300 mg.kg”1).

Os resultados mostrados indicam que a gastroproteção exercida pelo extrato de A. brachypoda não deve ser mediada pelo NO, pois mesmo com sua sintese bloqueada pelo L-NAME, a atividade foi verificada pela redução dos danos à mucosa gástrica, tanto dos animais que não receberam L-NAME quanto daqueles que o receberam.

-    Envolvimento dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção:

Na Figura 2, está representado graficamente o resultado da observação feita sobre o envolvimento de grupamentos sulfidrila na proteção à mucosa gástrica exercida pela administração oral de A. brachypoda (300 mg. kg"1) .

Os resultados obtidos demonstram que o grupo salina associado a NEM (B) não respondeu ao pré-tratamento com NEM, no entanto, uma análise sobre o resultado com os grupos tratados com carbenoxolona permite sugerir que A. brachypoda pode não depender de grupamentos sufidrila para promover proteção à mucosa gástrica, muito embora este modelo experimental tenha apresentado variação anormal no controle negativo.

-    Ensaios de atividade antioxidante:

Os ensaios avaliaram a atividade antioxidante das enzimas glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e os niveis de grupamentos sulfidrila (GSH) na mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida 5 por etanol.

Tabela 1 - Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda sobre a atividade enzimática de GR e GPx da mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de

úlcera induzida por etanol.

Tratamentos

GR (nmol/min/mg de proteina)

GPx (nmol/min/mg de proteina)

Salina

7,65 ± 0,37

19,39 ± 3,86

Lansoprazol

10,53 ± 0,42*

33,54 ± 2,12*

A. brachypoda

8,29 ± 0,85

21,91 ± 3,28

10    Os dados mostrados na Tabela 1 indicam que a A.

brachypoda não exerce ação sobre as enzimas GR e GPx, ao contrário do lansoprazol que apresentou maior atividade dessas duas enzimas na mucosa gástrica de ratos.

Tabela 2 - Efeito da administração oral do extrato das 15 raízes de A. brachypoda sobre os níveis de GSH na mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida

por etanol.

Tratamentos

GSH (nmol/mg de proteina)

Salina

LO \—1

\—1

+i

\—1 CO

Lansoprazol

13,45 ± 2,25*

A. Brachypoda

7,55 ± 2,09

Os niveis de GSH não foram mantidos ou aumentados pela administração oral de A. brachypoda aos ratos submetidos ao

modelo de úlcera induzida por etanol, já o tratamento com lansoprazol levou a preservação ou ao aumento dos niveis citosólicos de GSH.

- Úlcera induzida por ácido acético    - modelo

subcrôníco:

Avaliação da toxicidade subcrônica:

As Figuras 3, 4 e 5 são ilustrativas dos dados que representam indicativos de toxicidade subcrônica dos tratamentos experimentais.

Um análise da relação entre o peso dos órgãos e dos animais tratados por 7 dias mostrou que os grupos em que foi administrado lansoprazol e A. brachypoda apresentaram redução desta relação nos pulmões, este último tratamento também apresentou o mesmo efeito para o coração (Figura 3).

A Figura 4 mostra a mesma relação verificada na Figura 3, no entanto, a análise se deu após 14 dias de tratamento e não foram observadas diferenças significantes.

A Figura 5 mostra a evolução de peso corporal dos animais tratados subcronicamente e também serve como indicativo de toxicidade, embora tenha havido queda na média do peso corporal dos animais tratados com lansoprazol, nenhuma diferença estatística significativa foi observada.

Cicatrização da lesão:

As Figuras 6 e 7 representam os dados obtidos na verificação da área de lesão ulcerogênica medida após 7 e 14 dias consecutivos de tratamento.

Na Figura 6, observa-se que o tratamento com A. brachypoda promoveu redução da área de lesão após o periodo de 7 dias, bem como o grupo controle administrado com o

lansoprazol.

De acordo com a Figura 7, fica claro que o tratamento com A. brachypoda mantém seu efeito cicatrizante após 14 dias consecutivos de tratamento, sendo mais eficiente que o grupo controle lansoprazol.

A Figura 8 mostra a evolução do processo de cicatrização, evidenciado pela redução da área da lesão ao longo do periodo de tratamento. É importante ressaltar que, após 20 dias, as lesões são recuperadas fisiologicamente.

Os dados mostrados evidenciam a aceleração promovida pelos tratamentos com lansoprazol e A. brachypoda na recuperação da mucosa gástrica de ratos.

- Atividade da MPO:

As Tabelas 3 e 4 reúnem os dados obtidos na avaliação da atividade enzimática da enzima MPO.

Tabela 3. Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 7 dias consecutivos sobre a atividade da MPO da mucosa gástrica de animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por ácido acético.

Tratamentos

MPO (U/mg de proteina)

Salina

125,10 ± 41,62

Lansoprazol

110,50 ± 33,43

A. brachypoda

166,00 ± 21,61

Após 7 dias de tratamento, os grupos experimentais apresentaram elevada atividade da enzima MPO. Ainda, o grupo tratado com A. brachypoda apresentou valores mais elevados que os demais grupos, embora não tenha sido verificada diferença estatística.

Tabela 4. Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 14 dias consecutivos sobre a atividade da MPO

da mucosa gástrica de animais submetidos ao modelo de úlcera

induzida por ácido acético.

Tratamentos

MPO (ü/mg de proteina)

Salina

148,60 ± 40,30

Lansoprazol

98,05 ± 15,99*

A. brachypoda

64,74 ± 22,02**

Os grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda por 14 dias consecutivos tiveram redução da atividade da MPO, com maior significância para este último.

A Figura 9 reúne graficamente os resultados das Tabelas 3 e 4, comparando-os. Uma análise dos resultados obtidos para a atividade da MPO mostra que a mesma encontra-se alta após 7 dias de tratamento, sendo reduzida nos grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda por mais de 7 dias, sugerindo uma participação importante da enzima no processo de cicatrização.

- Análise histológica:

As figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E e 10F e 11A, 11B, 11C, 11D, 11E e 11F correspondem a fotomicrografias dos estômagos dos animais submetidos ao modelo subcrônico de úlcera induzida por ácido acético e tratados por 7 e 14 dias, respectivamente.

A análise das fotomicrografias mostradas na Figura 10 sugere que o tratamento com A. brachypoda promoveu recuperação da mucosa, manutenção das glândulas e redução da borda de lesão, o que caracterizou seu efeito protetor, no entanto verifica-se maior extensão da submucosa que pode estar associada ao infiltrado neutrofilico que se desloca para a mucosa.

A Figura 11 mostra que os grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda aceleraram a cicatrização da mucosa gástrica em relação ao grupo salina, o qual apresenta grande infiltrado neutrofilico nas camadas mucosa e submucosa. As imagens mostram intensa redução da lesão nos grupos experimentais, demonstrando a melhora promovida pela administração tanto de lansoprazol quanto de A. brachypoda.

-    Experimento de indução de úlcera por etanol:

A figura 12 evidencia que a atividade antiulcerogênica do extrato das raizes da planta A. brachypoda é melhor obtida para as doses de 300 mg.Kg”1.

As demais doses não apresentaram atividade significativa.

Em vista deste resultado, os experimentos subsequentes foram realizados com esta dose.

-    Experimento de indução de úlcera por AINE;

De acordo com os dados ilustrados na figura 13, o pré-tratamento com o extrato hidroalcoólico da planta A. brachypoda na dose de 300 mg.Kg”1 promove a proteção da mucosa no modelo de indução de úlcera por AINE.

-    Ligadura do piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico;

Os resultados apontados na tabela 5 abaixo mostram que o extrato hidroalcoólico das raizes da A. brachypoda possui atividade antissecretora, já que se observa um aumento no pH e uma diminuição do volume de secreção no grupo de animais tratados com o extrato, quando comparado com o grupo tratado com a solução salina.

Tabela 5    - Volume (mL) e pH da secreção ácida gástrica

medidos após a administração intraduodenal do extrato hidroalcoólico de A. Brachypoda no modelo de ligadura do piloro

Tratamento

Volume de secreção ácida gástrica (mL)

pH

Salina

0,51 10

4,90 0,13

Lansoprazol

0,81 0,15

5,41 0,04***

Cimetidina

0,31 0,03**

5,39 0,11***

A. brachypoda

0,47 0,09

5,19 0,05***

- Determinação da produção de muco:

Os dados ilustrados na figura 14 mostram que o tratamento com o extrato hidroalcoólico da A. brachypoda não interfere na produção de muco aderido à mucosa.

5    - Determinação da MPO e determinação dos niveis de GSH:

Os dados apresentados na tabela 6 abaixo mostram que o tratamento com o extrato hidroalcoólico de A. brachypoda mostrou-se eficaz em reduzir a atividade da MPO.

Tabela 6 - Atividade enzimática da MPO em ratos tratados com o 10 extrato hidroalcoólico (70%) das raizes da planta A. brachypoda

no modelo de úlceras induzidas por etanol.

Tratamentos

MPO

(U/mg de

proteina)

Salina

0,26

0,01

Lansoprazol

0,16

0, 04*

A. brachypoda

0,12

0,01**

1/1

REIVINDICAÇÕES

1.    Uso de compostos obtidos a partir de extratos da Arrabídaea brachypoda caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma composição farmacêutica para tratar doenças

5 ulcerogênicas.

2.    Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as doenças parasitárias são selecionadas do grupo que consistem em úlceras que acometem a pele, úlceras mucosas, úlceras serosas e as úlceras complexas.


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Arco seno da

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2/7


FIGURA 6


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FIGURA 7


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-<!    Dias de Tratamento



FIGURA 9

FIGURA 10A


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FIGURA 10C


FIGURA 10B



FIGURA 11C    FIGURA 11D

Área de Lesão Ulcerogênica

(mm 2)


Área de Lesão Ulcerogênica (mm2)


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FIGURA 14


Corante / Porção glandular (g)

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1/1

Resumo

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIULCEROGÊNICO

Esta

invenção

descreve o

uso de

compostos

obtidos

a

5

partir do

extrato

de raizes,

caules,

cascas e

folhas

de

espécies vegetais do gênero Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, para tratar doenças ulcerogênicas.