Uso de compostos obtidos a partir de extratos da arrabidaea brachypoda como antiparasitário

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 031927 9 A2
  • Data do depósito:
  • 12/12/2013
  • Data da publicação:
  • 13/10/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 33/02
    Agentes antiparas?ticos; / Antiprotozo?rios, p. ex. para leishmaniose, tricomoniase, toxoplasmose;
    ;
    A61P 33/06
    Agentes antiparas?ticos; / Antiprotozo?rios, p. ex. para leishmaniose, tricomoniase, toxoplasmose; / Antimal?ricos;
    ;
    A61K 31/352
    Prepara??es medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos; / Compostos heteroc?clicos; / tendo oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel, p. ex. fungicromina; / tendo an?is de seis membros com um oxig?nio como o ?nico hetero?tomo de um anel; / condensado com an?is carboc?clicos, p. ex. canabin?is, metantelina;
    ;

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIPARASITÁRIO. Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir do extrato de raí­zes, caules, cascas e folhas de espécies vegetais do gênero Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, no tratamento de doenças parasitárias como a malária, doença de Chagas e leishmaniose.

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Documento

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIPARASITÁRIO

Campo da invenção:

Esta

invenção

descreve o

uso de

compostos obtidos

a

partir do

extrato

de

raizes,

caules,

cascas

e folhas

de

espécies

vegetais

do

gênero

Arrabidaea, em

especial

a

Arrabidaea brachypoda,

também

conhecida como

cipó-una

ou

cervejinha do campo, no tratamento de doenças parasitárias como a malária, doença de Chagas e leishmaniose.

Fundamentos da invenção:

Protozoários são seres eucariontes unicelulares, os quais apresentam capacidade de deslocamento, heterotróficos ou não.

Divididos em mais de 15 filos, podem ser encontrados no solo, em ambientes aquáticos ou associados a outros seres vivos. Neste último caso, podem parasitar a espécie humana, provocando doenças como a malária, a doença de Chagas e a leishmaniose, as quais são transmitidas por meio de insetos.

Essas doenças foram denominadas doenças tropicais ou doenças dos trópicos, uma vez que são mais comuns em paises nos quais os fatores climáticos e de umidade favorecem a proliferação dos insetos transmissores dessas doenças.

Atualmente, elas estão bastante correlacionadas com fatores socioeconômicos, pois se manifestam mais nos paises pobres que, em sua maioria, se localizam nas regiões tropicais e não têm condições de implantar medidas efetivas de controle, prevenção e tratamento.

A malária é uma doença que, apesar dos significativos avanços nas estratégias de controle, continua sendo um problema para a humanidade, uma vez que é a quinta doença que mais mata no mundo.

Causada por protozoários do gênero Plasmodium, em especial as espécies P. falciparum, P. vívax, P. ovale e P. malaríae, e transmitidos ao homem por fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles infectadas, a doença se caracteriza por causar febres intermitentes, dores de cabeça, dores no corpo, anemia, ictericia e inchaço do figado e baço. Causada pelo P. falciparum, a malária cerebral ainda compromete progressivamente o sistema nervoso central.

O tratamento da malária é complexo, longo e, muitas vezes, ineficaz, uma vez que a reinfecção do paciente é comum, principalmente em locais endêmicos.

Estratégias sabidamente eficazes para o combate são pouco acessáveis nos paises endêmicos, como a educação da população de risco, a quimioterapia eficiente, o controle do vetor por meio de inseticidas e o uso de mosquiteiros impregnados com inseticidas para evitar a infecção.

Somando-se a isso, tem-se, ainda, o rápido surgimento de cepas de P. falciparum resistentes aos antimaláricos atualmente disponíveis, a ineficácia das vacinas e o desinteresse das indústrias farmacêuticas em desenvolver fármacos baratos e acessáveis contra a doença.

O tratamento da malária é feito por meio dos derivados da artemisinina (como artesunato e artemeter), um diterpeno extraido da planta Artemísía annua, originada na China.

O artesunato é de uso intravenoso, intramuscular e retal e o artemeter apresenta-se disponível apenas para uso intramuscular.

Do ponto de vista farmacológico, esses medicamentos são esquizonticidas rápidos, que atuam sobre os gametócitos de P. vivax. Estes medicamentos são indicados no tratamento da malária grave, principalmente a malária cerebral, devido a sua rapidez na redução da parasitemia. São bem tolerados pelos pacientes, com poucos efeitos adversos, sendo os mais relevantes: diarréia, dor abdominal e náuseas.

A quinina e os derivados cloroquina e mefloquina atuam como um esquizonticidas eritrocitários de ação rápida, com atividades também sobre gametócitos de P. vivax, P. ovale P. malaríae. Seus principais efeitos adversos são o cinchonismo (tinido, déficit auditivo transitório, tremores e distúrbios visuais), a epigastralgia, náuseas e vômitos, além de hipoglicemia quando em doses altas, sendo que todas as alterações revertem com a interrupção do medicamento. A infusão intravenosa pode ocasionar trombose, hipotensão arterial sistêmica e alterações de ritmo cardiaco, devendo-se diluir o fármaco e administra-lo lentamente.

As dosagens dos medicamentos são ajustadas conforme faixa etária e peso do paciente, de modo a garantir que o tratamento tenha o máximo possivel de eficácia com o minimo de toxicidade. Ainda, a avaliação da parasitemia após 24 horas do inicio da terapêutica é importante para observação da existência de falhas, sobretudo em enfermos que venham mantendo quadro clinico inalterado ou com piora.

A doença de Chagas, também denominada tripanossomiase americana, é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A doença é transmitida por insetos conhecidos como barbeiros, da familia Reduviidae e pertencentes aos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus.

Os sintomas da doença de Chagas podem variar durante o curso da infecção. Nos primeiros anos, na fase aguda, os sintomas são geralmente lentos, pouco mais do que inchaço nos locais de infecção. À medida que a doença progride, durante até cinquenta anos, os sintomas tornam-se crônicos e graves, tais como insuficiência cardiaca e desordens do sistema digestivo.

Na fase inicial aguda, a administração de fármacos, tais como nifurtimox, alopurinol e benznidazol, curam completamente ou diminuem a probabilidade de cronicidade em mais de 80% dos casos.

Se não tratada, a doença crônica é muitas vezes fatal, uma vez que os tratamentos medicamentosos atuais para esta doença são pouco satisfatórios. Os medicamentos têm efeitos colaterais significativos e são, muitas vezes, ineficazes, em especial na fase crônica da doença. A fase crônica é incurável, já que os danos em órgãos como coração e sistema nervoso são irreversíveis, sendo feito um tratamento apenas paliativo.

A doença de Chagas, juntamente com a doença do sono e a leishmaniose, está entre as doenças "extremamente negligenciadas" pela indústria farmacêutica, em razão da extrema pobreza dos pacientes.

A leishmaniose é uma doença crônica, de manifestação cutânea ou visceral, causada por protozoários flagelados do gênero Leishmania, da familia dos Trypanosomatidae. Existem diferentes formas da doença como, por exemplo, o calazar (leishmaniose visceral) e a úlcera de Bauru (leishmaniose tegumentar americana).

A leishmaniose é uma zoonose comum ao cão e ao homem. A doença é transmitida ao homem pela picada de mosquitos flebotomíneos, que compreendem os gêneros LutzomyiaPhlebotomus.

No Brasil, existem atualmente 6 espécies de Leishmania responsáveis pela doença humana e mais de 200 espécies de flebotomineos implicados em sua transmissão.

O diagnóstico é dado pela observação microscópica direta dos parasitas em amostras de linfa ou sangue ou biópsias de baço, após cultura, detecção do DNA ou testes imunológicos. O tratamento humano é feito por administração de compostos de antimônio, pentamidina, marbofloxacino anfotericina ou miltefosina.

A prevenção se faz por redes ou repelentes de insetos, pela construção de moradias humanas a distância superior a 500 metros da mata silvestre e pela erradicação dos Phlebotomus/Lutzomyia.

Por mais de 60 anos, o tratamento das leishmanioses é realizado com antimoniais pentavalentes antimoniato de N-metil glucamina e estibogluconato de sódio. Estas drogas são tóxicas, nem sempre efetivas, e, na LV, são usadas em esquemas prolongados.

O principal efeito colateral do antimoniato de N-metil glucamina é sua ação sobre o aparelho cardiovascular, sendo seu uso desaconselhável durante os 2 primeiros trimestres de gravidez.

Tratamentos alternativos são feitos com anfotericina B e suas formulações lipossomais, as pentamidinas (sulfato e mesilato) e os imunomoduladores (interferon gama e GM-CSF).

A anfotericina B encapsulada em lipossomas tem mostrado bons resultados, com cura de 90 a 95%, enquanto o miltefosine mostrou 95% de cura efetiva. Esta última tem a vantagem de ser de uso oral e bem tolerada, no entanto, por ser potencialmente teratogênica, seu uso é limitado para grávidas e nutrizes.

Em vista das dificuldades acima apontadas, tanto na prevenção quanto no tratamento das doenças, esta invenção propõe o uso de compostos obtidos a partir da Arrabidaea brachypoda no tratamento de doenças parasitárias como a malária, doença de chagas e leishmaniose.

Estado da técnica:

Documentos disponiveis no estado da técnica descrevem diferentes compostos obtidos a partir da Arrabidaea, bem como a incorporação destes em composições farmacêuticas.

O documento brasileiro PI 0600943-3 A2 descreve o uso de extratos fitoterápicos a base de Arrabidaea chica como antifúngico e antibacteriano. Os extratos podem ser utilizados como fármaco ou aditivo a cosméticos, podendo ser aplicados diretamente ou incorporados a um veiculo farmacológico ou cosmético.

No documento WO 2013/091056 são descritas composições farmacêuticas estáveis compreendendo o extrato de Arrabidae chica em sistemas de liberação controlada, na forma de lipossomas, microparticulas ou nanoparticulas.

No WO 0152809 são descritas preparações cosméticas ou farmacêuticas contendo uma quantidade ativa de extrato de Arrabidae chica, enquanto que em JP 2001/122763, descreve-se uma composição para uso externo compreendendo plantas, tais como aquelas do gênero Arrabidaea, bem como seus extratos.

Nenhum dos documentos do estado da técnica descreve o uso de compostos obtidos a partir da Arrabidaea brachypoda

para o tratamento de doenças parasitárias.

Sumário da invenção:

A presente invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir de extratos da Arrabidaea brachypoda no tratamento de doenças parasitárias, tais como a malária, doença de chagas e leishmaniose.

Breve descrição das figuras:

A Figura 1 é um gráfico que representa a inibição da invasão celular, demostrada por meio da porcentagem de macrófagos infectados, em que (A) é o controle, (B) é uma cultura tratada com benznidazol, (C) é uma cultura tratada com anfotericina B, (D) é uma cultura tratada com RAB-02 e (E) é uma cultura tratada com RAB-03.

A Figura 2A representa graficamente a contagem do número de tripomastigotas em camundongos infectados tratados com o composto RAB-02, em que (A) é o veiculo (controle) ,    (B) é benznidazol e (C) é o composto RAB-02

A Figura 2B representa graficamente a porcentagem de sobrevivência de camundongos infectados tratados com o composto RAB-02, em que (A) é o veiculo (controle), (B) é benznidazol e (C) é o composto RAB-02.

Descrição detalhada da invenção:

A invenção consiste no uso de compostos obtidos a partir de extratos de raizes, caules, cascas e folhas de espécies do gênero Arrabidaea, em especial, a partir de raizes de Arrabidaea brachypoda, conhecida como cervejinha do campo ou cipó-una, cujo extrato compreende frações enriquecidas em compostos que apresentam uma atividade de inibição in vitro em vários microrganismos causadores de doenças parasitárias.

Método de obtenção dos compostos:

Os compostos da presente invenção são obtidos a partir de extratos padronizados de espécies do gênero Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda.

Para a obtenção do extrato, a biomassa compreendendo raizes, caules, cascas, e folhas, bem como misturas destes, é extraida por meio de percolação, maceração soxhlet ou por meio de gases em estado supercritico, bem como uma mistura dessas técnicas.

A biomassa pode estar verde e/ou seca, pulverizada, moida, em pedaços e/ou esfarelada. De forma opcional, a biomassa é congelada antes de ser processada.

O congelamento prévio do material vegetal evita a degradação térmica provocada pelo aquecimento ao passar pelo moinho elétrico.

A extração é feita utilizando meio básico ou meio ácido, em meio aquoso ou utilizando solventes orgânicos, isolado ou em combinações.

Os ácidos podem ser ácidos fortes ou fracos, diluidos ou concentrados, isolados ou em misturas.

Em modalidades especificas da invenção, o ácido é selecionado dentre ácido acético, ácido cloridrico e ácido fórmico.

As bases, por sua vez, podem estar concentradas ou diluidas, isoladas ou em misturas.

Em modalidades especificas da invenção, a base é selecionada dentre hidróxido de amônia (NH4OH) e carbonato de sódio (Na2CC>3) .

O solvente orgânico é selecionado dentre aqueles que compreendem compostos halogenados, álcoois, aldeidos, éteres, ésteres, cetonas, alcanos, cicloalcanos, compostos fenólicos, benzenos e derivados, isolados ou suas misturas.

O extrato obtido pode ser seco com a tecnologia de secagem por pulverização (spray-drying), à pressão reduzida ou à temperatura ambiente.

Para a secagem por pulverização, as temperaturas de entrada e saida variam entre 150 e 190 °C e 80 e 90 °C, respectivamente. Já na secagem à pressão reduzida, a mesma varia entre 25 e 100 °C.

Os diferentes compostos são separados e purificados por meio de técnicas cromatográficas com ou sem pressão, como cromatografia a pressão atmosférica ou cromatografia a baixa, média ou alta pressão.

Para execução da técnica, pode-se utilizar uma fase estacionária normal, tal como a silica gel, ou uma fase inversa, tal como a C-8 ou C-18.

Ainda, pode-se utilizar a partição liquido/liquido, tal como a cromatografia contra corrente, ou a partição centrifuga, utilizando resinas de troca iônica ou membranas de filtração.

A fim de identificar as moléculas responsáveis pela atividade farmacológica, o extrato de raizes de Arrabidaea brachypoda é submetido a um fracionamento guiado.

O extrato é fracionado por cromatografia a pressão média (MPLC) em fase reversa, com um sistema de solventes apresentando gradiente por passos de metanol-água a partir de 10:90, com aumento gradual até 100%.

A pressão máxima é de 20 bar (2xl03 kPa) e as amostras são colocadas em um cartucho de introdução após sua mistura com a fase estacionária (silica) em uma proporção em peso

de 1:3.

As frações são testadas no teste antíparasítárío e aquelas que apresentaram os melhores resultados frente aos protozoários são analisadas por HPLC-UV.

A partir destas frações, são obtidos os compostos isolados RAB-Ol, RAB-02 e RAB-03, cujas estruturas são elucidadas através de métodos espectroscópicos (tal como ultravioleta - UV, ressonância magnética nuclear - RMN 1D e 2D, espectrometria de massa a baixa e alta resolução - MS e HRMS), além de reações quimicas e enzimáticas.

Os compostos isolados foram identificados como sendo flavonoides diméricos de fórmula I abaixo:

HO...    . - J'.H

em que, para RAB-01, R é hidroxila; para RAB-02, R é metoxila e para RAB-03, R é hidrogênio.

A estrutura dos mesmos é identificada por técnicas clássicas de elucidação estrutural, incluindo ultravioleta, ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa (MS).

Os dados referentes a ressonância magnética nuclear de hidrogênio (MeOD, 500 MHz), ressonância magnética nuclear de carbono (MeOD, 125 MHz) e espectrometria de massas para cada um dos componentes RAB-01, RAB-02 e RAB-03 estão descritos abaixo e nas tabelas 1, 2 e 3:

RAB-01 - Sólido amorfo vermelho; [a] d20'1 -108,43° (c 0.1 MeOH) ; UV Àmax (log e) 266 nm (5.02); 'h-RMN (CD3OD, 500 MHz)    e    1 3C-RMN    (CD3OD,    125    MHz) :    Tabela 1; ESI-MS    (modo

positivo):    m/z 525.1    [M+H]+; HRMS:    m/z 525.1926    [M+H] +

5 (calculado para C32H2807, 525.1913, A ppm = 1.3).

RAB-02 - Sólido amorfo laranja; [a]D20,9 -118,80° (c 0.1 MeOH); UV Àmax (log e) 254 nm (4.82); 'H-RMN (CD3OD, 500 MHz) e 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz): Tabela 1; ESI-MS (Modo positivo) m/z 539.1    [M+H]+; HRMS (modo positivo) m/z 539.

10    2095    [M+H]+ ]+ (calculado para C33H30O7,    539.    2070, A ppm =

4.6).

RAB-03 - Sólido amorfo    laranja; [a]D20,1    -82,86    (c 0.1

MeOH);    UV Amax    (log e)    266    nm (5.78); 'H-RMN (CD3OD, 500

MHz)    e    13C-RMN    (MeOD,    125    MHz):    tabela 1; ESI-MS    (modo

15 positivo) m/z 509.1    [M+H]+; HRMS (Pos. Mod): 509.1974[M+H]+

]+ (calculado para C32H2906, 509.1964, Appm = 2.0).

Tabela 1. Dados de RMN de 1H e RMN de 13C (500 e 125 MHz,

CD3OD, õ em ppm) do composto RAB-01.

XH

1 3 c

1

161.1

2

6.08 d, J = 2.2

92.8

3

161.1

4

5.94 d, J = 2.2

96.4

4a

157.8

6

4.78 d, J = 11.2

78.2

6a

2.22 dt, J = 11.2, 1.9 Hz

42.4

7

3.17 ddd, J = 5.5, 1.9, 1.6 Hz

34

7a

101.8

8

160.2

9

6.05 d, J — 2.1Hz

93

10

159.1

11

5.98 d, J = 2.1 Hz

96.5

11a

155.4

12a

5.28 d, J = 2.3 Hz

63.5

12b

103.8

1'

140.4

2' ,6'

7.24 d, J = 7.6 Hz

128.5

3' ,5'

7.38 m

129.5

4'

7.38 m

129.6

A

5.95 dd, J = 15.9, 5.5 Hz

130.7

B

5.81 dd, J = 15.9, 1.6 Hz

131.7

1' '

130.4

2'', 6''

7.05 d, J = 8.6 Hz

128.4

3 ' ' , 5 ' '

6.64 d, J = 8.6 Hz

116.2

4. .

157.7

1-OMe

3.81 s

56.1

8-OMe

3.62 s

55.9

4''-OMe

-

-

Tabela 2. Dados de RMN de 1H e RMN de 13C (500 e 125 MHz, CD3OD, õ em ppm) do composto RAB-02.

XH

1 3 c

1

160.9

2

6.08 d, J = 2.1 Hz

92.7

3

161,1

4

5.94 d, J = 2.1 Hz

96.3

4a

157.7

6

4.77 d, J = 11.3 Hz

78.1

6a

2.19 dt, J = 11.3, 1.9 Hz

42.3

7

3.17 ddd, J = 5.6, 1.9, 1.6 Hz

34

7a

101.6

8

160.2

9

6.05 d, J = 2.1Hz

93

10

159.2

11

5.98 d, J = 2.1 Hz

96.5

11a

155.3

12a

5.27 d, J = 2.3 Hz

63.4

12b

103.7

1'

140.4

2' ,6'

7.23 d, J = 7.0 Hz

128.5

3' ,5'

7.38 m

129.5

4'

7.38 m

129.5

A

5.99 dd, J = 15.8, 5.6 Hz

131.5

B

5.83 dd, J = 15.8, 1.6 Hz

131.3

1' '

131.1

2" , 6' '

7.11 d, J = 8.8 Hz

128.2

3'', 5''

6.75 d, J = 8.8 Hz

114.8

4' '

160.2

1-OMe

3.79 s

56.1

8-OMe

3.62 s

55.9

4''-OMe

3.73 s

55.6

Tabela 3. Dados de RMN de 1H e RMN de 13C (500 e 125 MHz, CD3OD, 5 em ppm) do composto RAB-03.

XH

1 3 C

1

161.1

2

6.08 d, J = 2.2 Hz

92.8

3

161.1

4

5.95 d, J = 2.2 Hz

96.4

4a

157.8

6

4.79 d, J = 11.3 Hz

78.2

6a

2.24 dt, J = 11.3, 1.9 Hz

42.2

7

3.21 ddd, J = 5.7, 1.9, 1.7 Hz

34.2

7a

101.5

8

160.2

9

6.05 d, J = 2.3 Hz

93

10

159.2

11

5.99 d, J = 2.3 Hz

9 6.6

11a

155.4

12a

5.28 d, J = 2.4 Hz

63.5

12b

103.8

1'

140.4

2 ' , 6'

7.24 d, J = 7.6 Hz

128.5

3 ' , 5 '

7.38 m

129.5

4 '

7.38 m

129.6

A

6.15 dd, J = 15.7, 5.7 Hz

133.8

B

5.91 dd, J = 15.7, 1.7 Hz

132

1 ' '

138.6

2' ', 6' '

7.18 m

127.2

3 ' ' , 5 ' '

7.18 m

129.4

4 ' '

7.10 m

128

1-OMe

3.79 s

56.1

8-OMe

3.61 s

55.9

4''-OMe

-

-

Incorporação dos compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em

composições farmacêuticas:

As composições farmacêuticas obtidas de acordo com a presente invenção compreendem os compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em quantidades padronizadas, em sua forma isolada ou em associação com outros produtos naturais ou sintéticos, em diferentes proporções.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas desta invenção compreendem os compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em uma faixa de concentração que varia de 0,001 a 50 % de pelo menos um dos compostos em sua forma livre ou na forma de sal (como cloratos, sulfatos ou boratos), associados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

As composições farmacêuticas podem ainda compreender fármacos, vitaminas, sais e/ou açúcares.

As composições ora descritas são apresentadas na forma de comprimidos, cápsulas gelatinosas (duras ou moles), microcápsulas, nanoparticulas, tinturas, xaropes, emulsões do tipo O/A e A/O, lipossomas, liquidos injetáveis, aerossóis, pós, liofilizados e similares, para serem administradas por via oral, tópica, injetável ou inalável.

As referidas composições são úteis no tratamento de doenças parasitárias como a malária, doença de chagas e leishmaniose, pela administração de doses que variam de 0,001 a 5000 mg/kg/dia, preferencialmente de 200 a cerca de 400 mg/kg/dia, divididas em uma ou mais vezes ao dia.