Processos de obtenção de biflavonóides, atividades fotoprotetora, antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento e seu uso em fármacos, nutracêuticos e cosméticos

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0305913-8 A2
  • Data do depósito:
  • 12/12/2003
  • Data da publicação:
  • 02/07/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • A61Q 5/00
    Prepara??es para tratamento dos cabelos;
    ;
    A61K 8/97
    Cosm?ticos ou prepara??es similares para higiene pessoal; / caracterizado pela composi??o; / contendo materiais, ou derivados destes, de constitui??o desconhecida; / de origem vegetal, p. ex. extratos de plantas;
    ;
    A61Q 19/08
    Prepara??es para tratamento da pele; / prepara??es antienvelhecimento;
    ;
    A61Q 11/00
    Prepara??es para tratar os dentes, a cavidade oral ou dentaduras, p. ex. dentifr?cios ou pastas de dente; enxaguat?rios orais;
    ;
    A61K 8/11
    Cosm?ticos ou prepara??es similares para higiene pessoal; / caracterizado pela forma f?sica especial; / Composições encapsuladas;
    ;
    A61Q 1/00
    Prepara??es para maquiagem; P?s para o corpo; Prepara??es para remover maquiagem;
    ;

"PROCESSOS DE OBTENÇÃO DE BIFLAVONÓIDES, ATIVIDADES FOTOPROTETORA, ANTIOXIDANTE, ANTIINFLAMATÓRIA E ANTIENVELECIMENTOS E SEU USO EM FÁRMACOS, NUTRACÊUTICOS E COSMÉTICOS". Refere-se a presente invenção a processos de obtenção de uma fração de biflavonóides de folhas de Araucaria angustifolia, atividades fotoprotetora, antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento e seu uso na fabricação de cosméticos e medicamentos úteis na fotoproteção, antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento. Mais especificamente, um dos processos de obtenção da fração de biflavonóides compreende as seguintes etapas: a) coleta de partes frescas da planta Araucaria angustifólia; b) secagem das partes da Araucaria angustifólia em estufa, a uma temperatura que varia entre 30 e 70,C; c) moagem da planta seca, em moinho de facas Tigre até uma granulometria de 2 a 6 mesh; d) maceração do pó obtido, numa temperatura entre 30 e 70C, com etanol ou qualquer solvente de polaridades semelhantes, por 2 a 6 dias; e) preparo do extrato através da filtragem da solução obtida por maceração com papel de filtro seguida de concentração sob pressão reduzida a uma temperatura de 40 . 20 C; até reduzir a 1/3 do volume inicial; f) precipitação da fração de biflavonóides, através da adição ao extrato obtido de 1 a 3 L de água, seguida de evaporação a uma temperatura entre 30 e 70C, à pressão reduzida para retirada do solvente; g) centrifugação ou decantação do precipitado resultante, para separar a fração de biflavonóides do sobrenadante, seguida da secagem do sólido obtido a temperatura de 25 . 20 C; h) caracterização da fração de bifiavonóides por cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas, cromatografia planar e ressonância magnética nuclear; i) identificação dos componentes da fração de bifiavonóides utilizando-se padrões estabelecidos como comparação.

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Documento

"Processos de obtenção de biflavonóides, atividades fotoprotetora, antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento e seu uso em fármacos, nutracêuticos e cosméticos"

Refere-se a presente invenção a processos de obtenção de uma fração de biflavonóides de folhas de Araucaría angustifolia, atividades fotoprotetora, antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento e seu uso na fabricação de cosméticos e medicamentos úteis na fotoproteção, antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento.

O estresse oxidativo provocado por espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, como oxigênio singlete (102), radicais superóxido (02*“), radicais hidroxila (*OH), radicais peroxila (R02‘), peróxido de hidrogênio (H202), radical óxido nítrico (NO) e peroxinitrito (ONOOH) têm sido relacionados com uma série de injúrias.

Há evidências crescentes de que estas espécies podem ser um dos fatores responsáveis por danos em ADN, proteínas e lipídios, in situ, contribuindo para o desenvolvimento de várias doenças degenerativas no ser humano (Helbock, H. J.; Beckman, K. B.; Ames, B. N. (1999) 8-hydroxydeoxyguanosine and 8-hydroxyguanine, as a marker odd cellular oxidative stress during carcinogenesis. Methods Enzymol. 300; 156-166). Podem ser gerados em processos metabólicos normais, como na ação de macrófagos do sistema imunológico, redução do oxigênio para água, dentre outros [Halliwell, B.; Gutteridge, J.M.C. (1998) Free Rad. Biol. & Méd., 3,h ed., Claredon Press, Oxford],

Estas espécies também podem ser geradas pela fotossensibilização da pele pela radiação solar, podendo ser um dos agentes etiológicos do câncer de pele e de outras diversas injúrias (Fuchs, J. (1998) Potential and limitations of the natural antioxidants RRR-alpha-tocopherol, L-ascorbic acid and p-carotene in cutaneous photoprotection. Free Radie. Biol. Med. 25; 848-873).

Dentre estas espécies reativas de oxigênio, o oxigênio singlete, uma forma eletronicamente excitada do oxigênio, tem sua formação induzida por raios UV, está relacionada com o envelhecimento precoce da pele através do estímulo de proteinases que degradam o colágeno (Epe, B. (1992) Genotoxicity of singlet oxygen. Chem. Biol. Internet 80; 239-260).

A exposição aguda e crônica à radiação solar tem sido relacionada com uma série de danos em pele, como a fototoxicidade, fotoalergia, agravamento das doenças dérmicas pré-existentes, fotodermatoses, bem como imunossupressão, fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese (Fucks, J; Packan, L. Photooxidative stress in the skin. In: Sies, H. ed. Oxidative Stress: Oxidants and antioxidants. London: Academic Press; 1991:559-583).

No Brasil, o câncer mais freqüente é o de pele,

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correspondendo à cerca de 25% de todos os tumores diagnosticados em todas as regiões geográficas. Mundialmente, é o tipo de câncer com o maior crescimento em incidência. A radiação ultravioleta natural proveniente do sol é o seu maior agente etiológico (INCA, www.inca.org.br).

De acordo com o comprimento de onda, os raios ultravioletas (raios UV) são classificados em raios UV-C, em raios UV-A (320-400nm) e em raios UV-B (280-320nm). Os raios UV-B são carcinogênicos, e a sua incidência tem aumentado muito, progressivamente à destruição da camada de ozônio, o que tem permitido, que um teor maior de raios UV-C alcancem a atmosfera terrestre, trazendo como conseqüência um aumento dos casos de câncer de pele.

Por sua vez, os raios UV-A independem daquela camada, e causam câncer de pele em quem se expõe a eles em horários de alta incidência, continuamente e ao longo de muitos anos. As pessoas de pele clara, que vivem em locais de alta incidência de luz solar são as que apresentam maior risco.

Como mais de 50% da população brasileira têm pele clara e se expõem ao sol muito e descuidadamente, seja por trabalho, seja por lazer, nada mais previsível e explicável do que a alta ocorrência do câncer de pele entre os brasileiros.

Os biflavonóides em geral foram estudados em relação à sua atividade farmacológica e foi demonstrada a atividade antiviral destes compostos, agindo contra vírus que atacam o sistema respiratório, vírus do herpes e HIV (Lin, Y. -M.; Flavin, M. T.; Schure, R.; Chen, F. -C.; Sidwell, R.; Bamard, D. L.; Huffman, J. H.; Kern, E. R. (1999) Antiviral activities of biflavonoids. Planta Medica 65; 120-125), além da atividade antifúngica (Krauze-Baranowska, M.; Cisowski, W.; Wiwart, M.; Madziar, B. (1999) Antifungal biflavones from Cupressocyparis leylandii. Planta Medica 65; 572-573).

Vários biflavonóides têm sido estudados devido às suas ações antiinflamatórias, dentre estes os representantes do grupo das amentoflavonas possuem a capacidade de inibir as cicloxigenases 1 e 2, que estão envolvidas na biossíntese de prostaglandinas (Bucar, F.; Jackak, S. M.; Noreen, Y.; Kartinig, T.; Perera, P.; Bohlin, L.; Shubert-Zsilavecz, M. (1998) Amentoflavone from Biophytum sensitivum and its effect on Cox-1/cox-2 catalyzed prostaglandin biosynthesis. Planta Medica 64; 373-374).

Podem ainda inibir enzimas como as fosfolipases, fosfodiesterases e lipoxigenases (Lee, H. S.; Oh, W. K.; Kim, B. Y.; Ahn, S. C.; Kang, D. O.; Shin, D. I.; Kim, J.; Mheen, T.-l.; Ahn, J. S. (1996) Inhibition of phospholipase Cy1 activity by amentoflavone isolated from Selaginella tamariscina. Planta Medica 62; 293296; Kim, H. P.; Mani, I.; Iversen, L.; Ziboh, V. A. (1998) Effects of naturally-occurring flavonoids and biflavonoids on epidermal cyclooxygenase and lipoxygenase from guinea-pigs. Prostaglan. Leucotr. Essent. Fatty Acid s 58; 17-24., 1998; Saponara, R.;

Bosisio, E. (1998) Inhibition of cAMP-phosphodiesterase by biflavones of Ginkgo biloba in rat adipose tissue. J. Nat. Prod. 61; 1386-1387).

Estudos demonstraram que ratos com artrite, ao receberem injeções intraperitoniais de ginkgetina, uma amentoflavona extraída da Ginkgo biloba, reduziram em até 84%, as inflamações causadas pela injúria com doses de 20 mg/Kg/dia, por 16 dias. Acredita-se que este fato deve-se à capacidade desta droga em inibir a fosfolipase A2 e inibir a proliferação de linfócitos, também, há hipóteses de que estas moléculas ajam como antioxidantes, suprimindo as espécies reativas ou quelando metais de transição que podem estar envolvidos no processo de formação de espécies reativas (Kim, H. K.; Son, K. H.; Chang, H. W.; Kang, S. S.; Kim, H. P. (1999) Inhibition of rat adjuvant-induced arthritis by ginkgetin, a biflavone from Ginkgo biloba leaves. Planta Medica 65; 465-467).

A Araucaria angustifolia (Bert) O. Kuntz é uma conífera endêmica das regiões sul e sudeste do Brasil e, no passado, foi utilizada em larga escala pela indústria madeireira até ser ameaçada de extinção. Os biflavonóides presentes são do tipo amentoflavona com a dimerização entre os carbonos C3’ e C8” (Fonseca, F. N., Ferreira, A. J. S.; Sartorelli, P.; Lopes, N. P.; Floh, E. I. S., Handro, W. and Kato, M. J. (2000) Phenylpropanoids derivatives and biflavones at different stages of differentiation and development of Araucaria angustifolia. Phytochemistry 55; 575-580).

Os biflavonóides amentoflavona e ginkgetina presentes em Araucaria angustifolia também são constituintes da Ginkgo biloba.

A Ginkgo biloba é a fonte de biflavonóides com o maior número de estudos, publicações e patentes. Existem patentes descrevendo a atividade fotoprotetora e antienvelhecimento tais como a patente japonesa JP5032556, de Kose KK; a patente japonesa JP8133939-A, de Pola Chem. Ind. Inc. e a patente japonesa JP9263534-A, da empresa Sunstar. Além disso, podem ser encontradas patentes de preparações cosméticas e sabonetes de Ginkgo biloba, com a finalidade de agir como agentes antienvelhecimento e hidratante, tais como na patente francesa FR2663848-A, de Raquet, J.P. e na patente coreana KR9310382-B1, de Song, K. Também para a redução de depósitos de gordura para combater a celulite tais como a patente européia EP427026-A2, de Bombardell, e o pedido PCT WO9717056-A, de Fabre.

Além do processo de produção do chá de folhas de Ginkgo biloba e sua atividade revigorante de Wang, J. patente chinesa CN11288674-A e também, bebidas contendo ginkgetina para o revigoramento mental, tais como a de Shen, Y. correspondente a patente chinesa CN1223821-A e como substituto da cafeína, tal como a patente americana de Zhou, J.H., de número US 6,416,806-B1

O objetivo da invenção ora proposta é a obtenção de uma fração de biflavonóides de Araucaria angustifolia, através dos processos ora descritos,

que será utilizada na fabricação de produtos com fins antienvelhecimento, antioxidante, fotoprotetora e antiinflamatório, bem como a associação desta fração de biflavonóides com compostos com a mesma finalidade. Além da obtenção de uma fonte alternativa brasileira para a fração de biflavonóides extraída da Ginkgo biloba. Além disso, o 5 processo descrito utiliza solventes como etanol ou acetona, representando uma redução de resíduos nocivos na matéria-prima, redução de custo e de resíduos orgânicos para descarte.

Esta invenção também possibilita a utilização da araucária como fonte renovável visando o reflorestamento e utilização alternativa para a indústria 10 madeireira, considerando-se que não é necessária a derrubada da árvore para a obtenção da fração de biflavonóides.

O presente invento será descrito com base em um processo preferencial de obtenção do produto, e com base nas figuras em anexo, dadas a título meramente exemplificativo, mas não limitativo, nas quais:

15    - Figura 1 - Estrutura geral de biflavonóide do tipo amentoflavona, com a ligação entre

os monômeros na posição 3’ e 8”.

- Figura 2 - Composição centesimal de biflavonóides em folhas de Ginkgo biloba e Araucaría angustifolia.

De acordo com a presente invenção, o processo de 20 obtenção da fração de biflavonóides compreende as seguintes etapas:

a)    coleta de partes frescas da planta Araucaría angustifolia;

b)    secagem das partes da Araucaría angustifolia em estufa, a uma temperatura que varia entre 30 e 70°C;

c)    moagem da planta seca, em moinho de facas Tigre até uma granulometria de 2 a 6 25 mesh;

d)    maceração do pó obtido, numa temperatura entre 30 e 70°C, com etanol ou qualquer solvente de polaridades semelhantes, por 2 a 6 dias;

e)    preparo do extrato através da filtragem da solução obtida por maceração com papel de filtro seguida de concentração sob pressão reduzida a uma temperatura de 40 ± 20

30    °C; até reduzir a 1/3 do volume inicial;

f)    precipitação da fração de biflavonóides, através da adição ao extrato obtido de 1 a 3 L de água, seguida de evaporação a uma temperatura entre 30 e 70°C, à pressão reduzida para retirada do solvente;

g)    centrifugação ou decantação do precipitado resultante, para separar a fração de 35 biflavonóides do sobrenadante, seguida da secagem do sólido obtido a temperatura de

25 ± 20 °C;

h)    caracterização da fração de biflavonóides por cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas,

cromatografia planar e ressonância magnética nuclear;

i) identificação dos componentes da fração de biflavonóides utilizando-se padrões estabelecidos como comparação nos ensaios descritos neste item.

Um outro processo de extração da fração de biflavonóides compreende as seguintes etapas:

a)    coleta de partes frescas da planta Araucaria angustifolia;

b)    secagem das partes da Araucaria angustifolia em estufa, a uma temperatura que varia entre 30 e 70°C;

c)    moagem da planta seca, em moinho de facas Tigre até uma granulometria de 2 a 6 mesh;

d)    maceração do pó obtido, numa temperatura entre 30 e 70°C, com acetona:água 1:1 ou em qualquer proporção, por 2 a 6 dias;

e)    preparo do extrato através da filtragem da solução obtida por maceração com papel de filtro até evaporar toda acetona à pressão reduzida a uma temperatura de 40 ± 20 °C;

f)    adição de uma solução de KOH (2,5%) ao extrato obtido na etapa anterior até a dissolução do precipitado;

g)    adição de uma solução ácida à solução até alcançar um pH em torno de 4,0, seguida da retirada do precipitado por centrifugação e dissolução deste em uma solução etanokágua quente (1:1);

h)    retirada do precipitado formado após o resfriamento da solução por centrifugação, decantação ou filtração, seguida da secagem do sólido obtido a uma temperatura de 25 ± 20°C;

i)    caracterização da fração de biflavonóides por cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas, cromatografia planar e ressonância magnética nuclear;

j)    identificação dos componentes da fração de biflavonóides utilizando-se padrões estabelecidos como comparação nos ensaios descritos neste item.

Uma variação deste segundo processo de extração é a utilização de hidróxido de sódio na etapa de maceração da amostra. Após esta etapa, o extrato de NaOH é filtrado em papel de filtro e o pH é ajustado em torno de 4,0 com a adição de um ácido. O precipitado formado é então dissolvido em uma solução de etanokágua (1:1) e, após o resfriamento, o precipitado formado é retirado por centrifugação, decantação ou filtração. O produto então é seca a temperatura de 25 ± 20°C. A amostra então é analisada conforme descrito anteriormente.

A avaliação das atividades antienvelhecimento, antioxidante, fotoprotetora e antiinflamatória compreende os seguintes ensaios:

1 - A atividade antioxidante e antienvelhecimento é avaliada pela proteção promovida contra danos em ADN plasmidial e aminoácidos provocados por espécies reativas;

2    - A atividade fotoprotetora é comprovada utilizando-se o modelo de peroxidação, induzido por radiação UV, em lipossomos de fosfatidilcolina. Os níveis de peroxidação são analisados pela formação de TBARS [Mandai, T. K.,Chatterji, S. N. (1980). Ultra Violet and sunlight induced lipid peroxidation in liposomal membrane. Radiat. Res. 83,

5    290-302], Danos em ADN de timo de bezerro provocados pela radiação UV também são

analisados medindo-se a formação do produto oxidado 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina (Shiguenaga, M. K.; Park, J.-W.; Cundy, K. C.; Gimeno, C. J.; Ames, B. (1990) In vivo Oxidative DNA damage: Measurement of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in DNA and urine by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Meth. 10 Enzymol. 186; 521-530.). O espectro de absorção da fração de biflavonóides compreende regiões do UV-C, UVB e UVA, sendo um potente filtro contra estes raios.

3    - A atividade antiinflamatória é determinada utilizando-se kits (Cayman Chemical Company, EUA) para a avaliação da capacidade destes compostos em inibir enzimas envolvidas no processo de inflamação.

15    A composição cosmética preparada com os biflavonóides

obtidos pelos processos da presente invenção pode conter, além da combinação de princípios ativos descritos, e veículos apropriados, os ingredientes ou adjuvantes comuns utilizados na produção destas composições. Eles podem conter, em particular, solventes como a água, solventes orgânicos (álcoois ou óleos, por exemplo) ou 20 silicones, agentes espessantes, surfactantes, polímeros, óleos sólidos (graxa ou lanolina, por exemplo), hidratantes, preservadores, modificadores de pH, corantes, flavorizantes, substâncias que absorvem radiação ultravioleta, bronzeadores (diidroxiacetona) e semelhantes.