Promotor derivado de genes relativos à rab, composições e métodos de aplicação

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 033503 4 A2
  • Data do depósito:
  • 28/12/2012
  • Data da publicação:
  • 05/11/2002
Inventores:
  • Classificação:
  • A01H 5/00
    Plantas flor?feras, i.e. angiospermas;
    ;
    C12N 15/09
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante;
    ;
    C12N 15/87
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Introdu??o de material gen?tico ex?geno usando processos n?o-inclu?dos em outro local, p. ex. cotransforma??o;
    ;
    C12N 15/81
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Introdu??o de material gen?tico ex?geno usando vetores; Vetores; Utiliza??o de hospedeiros para os mesmos; Regula??o da express?o; / Vetores ou sistemas de express?o especialmente adaptados a hospedeiros eucariotos; / para fungos; / para leveduras;
    ;

PROMOTOR DERIVADO DE GENES RELATIVOS À RAB, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE APLICAÇÃO. A presente invenção se refere a uma sequência de polinuceotídeos capaz de modificar a expressão de forma eficiente de um ou mais genes de interesse em plantas, particularmente do gênero Musa, bem como as ferramentas para obtenção de plantas geneticamente modificadas utilizando tal sequência e uso da mesma. As possibilidades de uso da invenção são amplas, destaca a criação de novas cultivares nutricionalmente mais enriquecidas, mais adaptadas e/ou mais resistentes, como por exemplo, a expressão de genes em plantas para conferir resistência a patógenos, como o Mycosphaerella fijiensis.

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Documento

Relatório Descritivo de Patente de Invenção: “PROMOTOR DERIVADO DE GENES RELATIVOS À RAB, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE APLICAÇÃO”.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a uma sequência de polinucleotídeos capaz de modificar a expressão de um ou mais genes de interesse em plantas, particularmente do gênero Musa, ferramentas para obtenção de plantas geneticamente modificadas utilizando tal sequência e uso da mesma.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A banana (Musa spp.) é uma espécie cultivada em mais de 100 países tropicais e subtropicais. Esta fruta é o alimento básico na dieta de mais de 400 milhões de pessoas, possuindo um importante papel social e econômico nos países produtores. A banana é uma cultura bastante versátil, capaz de ser cultivada em diferentes ambientes, o que a torna interessante para a produção por pequenos produtores, pode ser produzida o ano todo além de manter a fertilidade do solo.

No aspecto nutricional, a banana é uma importante cultura de segurança alimentar, sendo considerada uma rica fonte de energia, sais minerais e vitaminas. A produção anual mundial de banana ultrapassa 100 milhões de toneladas, sendo que cerca de 87% de toda banana cultivada em todo o mundo é produzida por pequenos produtores para consumo doméstico ou para venda em mercados locais e regionais. Os 13% restantes da produção mundial de banana destina-se ao mercado exportador e está sob o domínio de grandes multinacionais americanas. Para muitos países, sobretudo os da América Latina e Caribe, a exportação de banana constitui uma importante fonte de divisas estrangeiras.

O cultivo da bananeira é afetado por diversos problemas fitossanitários causados por fungos, bactérias, vírus, nematoides e insetos. Os fungos são indiscutivelmente os agentes infecciosos de maior importância para a bananicultura brasileira, e causam diversas doenças de pré e pós-colheita, tais como, “Mal-do-Panamá” (Fusarium oxysporum f.sp. cubense), Sigatoka amarela (Mycosphaerella musicolá) e Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis). O Moko ou murcha bactcriana, causada por Ralstonia solanacearum, raça 2 [Pseudomonas solanacearum (Smith)], é também um dos graves problemas que afeta a bananicultura. O nematoide de maior importância para a bananeira é o Radopholus similis; e a broca-do-rizoma, causada pelo Cosmopolites sordidus, é o principal inseto praga. As pragas e doenças são responsáveis por severas perdas na produção de banana, que, dependendo dos fatores envolvidos, pode ser de até 100%, uma vez que, em muitos casos, não existe alternativa alguma de controle.

Devido à ausência de variedade genética e a alta incidência de pragas, a bananicultura é uma das produções com maior uso de pesticidas no mundo, constituindo uma ameaça ao meio ambiente e à saúde humana nos países produtores pobres e à viabilidade econômica das

indústrias. Essa condição é extremamente prejudicial à cultura mundialmente e lidera a lista de principais ameaças ambientais devido ao uso maciço de fungicidas.

A importância do controle genético dos referidos patógenos é de caráter urgente, já que a produção da banana se sustenta fortemente no uso em grande escala de fungicida, que vem passando por uma série de análises públicas de caráter crítico por motivos de segurança humana, biossegurança e ambiental.

O cultivo comercial de banana demanda, no seu contexto global, um amplo uso de pesticidas, levando a uma constante ameaça ao meio ambiente e à saúde humana nos países produtores pobres e à viabilidade econômica das indústrias. Somente um patógeno, o fungo M. fijiensis exige em alguns países da América Latina entre 50-60 aplicações anual de fungicida. A importância do controle genético desse patógeno é de caráter urgente, já que a produção da banana em nível mundial vem passando por uma série de análises públicas de caráter crítico que demandam segurança alimentar e ambiental, dentro de um contexto de sustentabilidade da cultura.

O M. fijiensis é um ascomiceto haplóide hemibiotrófico. Esse fungo tem uma fase de crescimento filamentosa, podendo ser mantido em meio de cultura líquido ou sólido. Com um sistema reprodutivo bipolar, heterotálico, seus cruzamentos podem ser feitos facilmente em laboratório (Mourichon e Zapater 1990). Esse fungo foi descrito a partir de amostras coletadas no Vale Sigatoka, nas Ilhas Fiji, sendo um bom exemplo da rápida e recente propagação global de um fungo ameaçando a produção de banana. O agressivo M. fijiensis espalhou-se mundo

r    f

Prata” e “Cavendish”, que


afora de forma efetiva, sendo agora o maior obstáculo à produção de banana na Asia, África, Caribe e América do Sul (Carlier et al., 2000). Os prejuízos na produtividade causada pela Sigatoka negra podem ultrapassar 50%. A Sigatoka negra resulta no amadurecimento prematuro da fruta, em lesões necróticas nas folhas e decomposição, levando a uma significativa perda na produtividade em variedades mais sensíveis, corno os grupos

representam aproximadamente 65% e 30% da produção de banana no Brasil respectivamente.

A produção de banana do subgrupo Cavendish no Brasil (‘Nanica’, ‘Nanicão5, ‘Grande naine’, 'Williams’, etc.) está, assim, ameaçada, tendo ficado totalmente dependente de controle químico, pois não existem variedades deste grupo de bananas com resistência ao fungo causador desta doença. O alto custo do controle químico para essa doença, que em regiões da América do Sul e Central chega a exigir entre 50 e 60 aplicações anuais de fungicida (Gasparotto et al, 2001), certamente inviabilizará a produção econômica de diversas variedades de banana no Brasil, como a banana ‘Maçã’ e as bananas do grupo Cavendish. Com uma maior dispersão do fungo, cresce também o risco de quebra da resistência encontrada nas variedades do grupo Prata.

Além disso, a enorme dependência no controle usando-se fungicidas exige estratégias integradas para impedir que o patógeno desenvolva uma resistência ao fungicida. A resistência a fungicidas (Marin et al., 2003, Plant Disease 87:208-222; Romero et al. (1997) Phytopathology, 87( 1 ):96-l00; Sierotski et al, 2000, Pest Management Science 56:833-841) contribuiu para o desenvolvimento de novas variedades resistentes essenciais para a indústria de banana, seja através da seleção dentre os recursos genéticos existentes ou através da geração de novas variedades por hibridação, ou ainda através do desenvolvimento de bananas modificadas geneticamente.

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Na maior parte das lavouras comerciais, o melhoramento genético depende de cruzamentos entre as melhores variedades e a seleção da progenia mais adequada. No caso da banana, as cultivares evoluíram das espécies selvagens asiáticas diplóides e triplóides M. acuminata (Genoma A) e M. halhisiana (Genoma B). Espécies selvagens são normalmente seminíferas, embora algumas diplóides sejam partenocárpicas. A maior parte das variedades comerciais cultivadas atualmente é de triplóides estéreis que desenvolvem os frutos por partenorcapia. Consequentemente, a base genética é restrita, sendo a diversidade dependente de mutações somáticas. Essa pequena variedade genética resultou em uma cultura com pequena resistência a pragas e doenças e, por esse motivo, algumas cultivares como Gros Michel e Grande Naine em particular encontram-se em risco (Janick, 1998, Acta Horticulturae 490:39-45).

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Uma alternativa ao melhoramento genético clássico é a engenharia genética, que permite a manipulação direta do genoma do organismo e não depende de demorados cruzamentos no campo e da disponibilidade de variedade genética na espécie. As técnicas de engenharia genética envolvem a inserção de sequências de polinucleotídeos no genoma de organismos, visando à expressão de novos genes em uma determinada espécie ou linhagem. A transgenia consiste na inserção de genes de espécies não relacionadas, mas esta técnica sofre críticas uma vez que não se sabem todas as possíveis consequências no ambiente e na saúde humana da introdução dessas variedades transgênicas.

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A cisgcnia consiste da utilização de ferramentas de engenharia genética para manipular genes provenientes da mesma espécie, ou de espécies próximas o suficiente em que haja cruzamento sexual entre ambas e, consequentemente, a transferência gênica horizontal. Dentre alguns dos benefícios da cisgcnia em relação ao melhoramento clássico estão: a possibilidade de controle e regulação da expressão gênica, da redução do tempo e custo para a produção de novas cultivares através da introdução de genes de interesse e principalmente, a possibilidade de obtenção de resistência multigênica durável (estável) (Schouten et al., (2006) EMBO reports, v.7(8): 750-753).Uma vez que não são geradas plantas que não poderíam existir por processos








naturais, acredita-se que essa abordagem envolva menos riscos para o ambiente e também, para a saúde humana. Os poucos promotores conhecidos para plantas do gênero Musa e que não sejam provenientes do genoma de vírus ou de outras espécies vegetais não relacionadas (Wang e Peng, (2001) Sheng Wu Gong ChengXue Bao, 17(4):428-3; Braithwaite et ah, (2004) Plant Cell Rep23(5):319-26) são provenientes do gene da Actina em banana, descritos nas patentes números US2005102711 e W00056863, ou associado ao gene da ACC oxidase, que sintetiza uma enzima responsável pela biossíntese do etileno, descrito no documento W09738106.

SUMÁRIO PA INVENÇÃO


A invenção se refere a uma sequência de polinuceotídeos capaz de modificar a expressão de forma eficiente de um ou mais genes de interesse em plantas, particularmente do gênero Musa, bem como as ferramentas para obtenção de plantas geneticamente modificadas utilizando tal sequência e uso da mesma. As possibilidades de uso da invenção são amplas, destacando a criação de novas cultivares nutricionalmente mais enriquecidas, mais adaptadas e/ou mais resistentes, como por exemplo, a expressão de genes em plantas para conferir resistência a patógenos, como o Mycosphaerella fijiensis.

O polinucleotídeo de acordo com a presente invenção apresenta homologia com a sequência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NOl, tendo 50% de identidade, preferencialmente 60%, preferencialmente 70%, preferencial mente 80%, preferencialmente 90%, mais preferencial mente 95% ou superior.

Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo que seja substancialmente similar à SEQ ID NOl; sequência reversa de SEQ ID NOl; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NOl.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5’-3\ uma sequência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma sequência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção “sense” ou “antisense”. Preferivelmente, a sequência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a sequência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da


técnica (vide Benjamin Lênin, Genes VIII , capítulo 9) como o termina dor da nopalina sinta se de A. tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.


Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progênie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.


Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.


Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.


Ainda cm outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não transformadas, ou de tipo selvagem.


Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será mais bem compreendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS


Figura 1. Mapa linear do vetor pCAMBIAI391z com o promotor descrito cm SEQ ID NOl (Prom_Musa_Embrapa_002), com os sítios de restrição das enzimas utilizadas.

Figura 2. Controle negativo da transformação (sem vetor). Suspensões celulares da variedade Williams, após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.


Figura 3. Suspensões celulares da variedade Williams transformadas com o vetor pCAMBIA139lz vazio (sem promotor 35S) servindo como controle negativo da transformação,

após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.

Figura 4. Controle positivo da transformação (promotor 35S GUS Intron). Suspensões celulares da variedade Williams, após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.

Figura 5. Suspensões celulares da variedade Williams transformadas com o promotor Ubi (ubiquitina), após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.

Figura 6. Suspensões celulares da variedade Williams transformadas com o promotor e35S, após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.

Figura 7. Suspensões celulares da variedade Williams transformadas com o promotor de interesse definido em SEQ ID NOl (Prom_MusaJEmbrapa__002), após coloração com GUS. Número de dias decorridos da transformação genética: A) 6 dias, B) 2 meses, C) 6 meses, D-E) folha e raiz com 11 meses.