Metodologia de biofuncionalização e caracterização de nanocompósitos magnéticos e base de carbono e cobalto para detecção de micro-organismos patogênicos

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 010598 8 A2
  • Data do depósito:
  • 30/04/2013
  • Data da publicação:
  • 31/12/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/569
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / para micro-organismos, p. ex. protozo?rios, bact?rias, v?rus;
    ;
    G01N 33/543
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / com um portador insol?vel para imobiliza??o de substâncias imunoqu?micas;
    ;
    G01N 33/577
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / envolvendo anticorpos monoclonais;
    ;
    G01N 33/547
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / com um portador insol?vel para imobiliza??o de subst?ncias imunoqu?micas; / sendo o portador org?nico; / Resina sint?tica; / com ant?geno ou anticorpo ligado ao portador via um agente de ponte;
    ;

METODOLOGIA DE BIOFUNCIONALIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCOMPÓSITOS MAGNÉTICOS E BASE DE CARBONO E COBALTO PARA DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS PATOGÊNICOS. A presente invenção refere-se à metodologia de preparação de nanocompósitos magnéticos a base de carbono e cobalto (NCM-C/Co) para detecção de micro-organismos patogênicos. Em particular, a metodologia aqui descrita é baseada na adsorção de moléculas biológicas (proteínas e anticorpos) na superfície dos NCM-C/Co e na capacidade do complexo formado (NCM-C/Co e moléculas biológicas), capturar, através de separação imunomagnética (SIM), leptospiras patogênicas a partir de cultivos de Leptospira spp. e artificialmente contaminados com outros micro-organismos. O desenvolvimento de metodologias alternativas às atualmente importadas, bem como de materiais nanoestruturados em solo brasileiro é estratégio para o avanço tecnológico do país. A sequência metodológica descrita aqui pode ser utilizada em laboratórios de bacteriologia e imunologia e incrementa o isolamento in vitro de patógenos e sua identificação através de testes moleculares

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Documento

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "Metodologia de biofuncionali zação e caracterização de nanoeompósitos magnéticos a base de carbono e cobalto para detecção de micro-organismos patogênicos"

5

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à metodologia de preparação de nanoeompósitos magnéticos a base de carbono e cobalto (NCM-C/Co) para detecção de micro-organismos 10 patogênicos. Em particular, a metodologia aqui descrita é baseada na adsorção de moléculas biológicas (proteínas e anticorpos) na superfície dos NCM-C/Co e na capacidade do complexo formado (NCM-C/Co e moléculas biológicas), capturar, através de separação imunomagnética (SIM), 15 leptospiras patogênicas a partir de cultivos de Leptospira spp. e artificialmente contaminados com outros microorganismos.

0 desenvolvimento de metodologias alternativas às atualmente importadas, bem como de materiais 20 nanoestruturados em solo brasileiro é estratégico para o avanço tecnológico do país. A sequência metodológica descrita aqui pode ser utilizada em laboratórios de bacteriologia e imunologia e incrementa o isolamento in

vitro de.....patógenos e.....sua.....identificação......através.........de..... testes

moleculares.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

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Da nandbiotecnologia

A geração de novas tecnologias (metodologias ou insumos biotecnolôgicos) utilizando a nanobiotecnologia vem contribuindo para o avanço científico e tecnológico do 10 País, especialmente por parte das Universidades Brasileiras. Os produtos obtidos através de tecnologias baseadas em nanobiotecnologia vem tornando o país cada vez mais independente da necessidade de importação. Entretanto, até o presente momento, a produção científica nacional com 15 base em nanobiotecnologia contribui com menos de 1 % das patentes geradas mundialmente, mostrando que há ainda uma necessidade maior de utilização desse setor tecnológico.

Dos nanocompósitos magnéticos (NCM)

20    A utilização de NCM, especialmente na área da saúde,

torna-se cada vez mais comun para a prevenção de doenças, entrega de drogas, tratamento do câncer, transfecção celular e separação de células ou biomoléculas. Nesse contexto, o alto desempenho magnético de compósitos a base

dê.........carbono e cobalto (NCM-C/Co)......possibilita......a.......utilização

desses insumos para diversas aplicações biotecnológicas

como,.....por exemplo,.....em ensaios de SIM associada.....a reação em

cadeia da polimerase (SIM-PCR) e ao cultivo celular (SIM-5 CC). A possibilidade de modificar a superfície dos NCM por agentes químicos, possibilita o ancoramento de grupos funcionais tais como carboxil (-COOH), amino (-NH2), hydroxil (-H0), hidrazida [ (Ri=0) R2-N-N-R3R4], clorometil (CH3OCH2CI) e silanol (SiH3OH) . Por esse motivo, uma grande 10 variedade de moléculas pode ser imobilizada com o propósito de capturar o alvo específico.

Mais de 95% das mortes causadas por doenças infecciosas se devem à falta de medidas eficazes de diagnóstico e tratamento. A fim de diminuir esses índices, 15 os grandes centros de pesquisas e laboratórios de diagnóstico vêm utilizando materiais nanoestruturados em diversas metodologias, como uma alternativa para a melhoria das atuais técnicas de imunodiagnóstico.

20.....Da separação inunomagnética (SIM)

A SIM é uma técnica imunológica de separação e concentração de micro-organismos que tem sido aplicada na detecção de bactérias patogênicas em alimentos ou fluídos biológicos. Inúmeras vantagens são atribuídas à SIM como

ferramenta laboratorial, tais como.....a capacidade......de......reduzir

o tempo de isolamento ao micro-organxsmo m»u e ao

possibilidades de......eliminação de contaminantes, j á que é

possivel realizar diversas lavagens com o complexo 5 imunoseparado. Após a SIM, testes laboratoriais podem ser realizados para a detecção do alvo capturado, dentre eles a reação em cadeia da polimerase (PCR) apresenta maior facilidade de execução, rapidez na obtenção de resultados e boa sensibilidade e especificidade quando comparados às 10 metodologias convencionais de cultivo e detecção de microorganismos. Além da aplicação no diagnóstico direto, a SIM pode ser utilizada na otimização do isolamento de agentes patogênicos fastidiosos a partir de fluídos ou tecidos de animais. Esta aplicação pode auxiliar na obtenção de novas 15 cepas, possibilitando análises epidemiológicas, antigênicas e genéticas que contribuiríam para a formulação de novas formas de controle e prevenção de doenças causadas por micro-organismos patogênicos.

20 Da leptospicose

A leptospirose é uma doença infecciosa sistêmica causada por mais de 260 sorovares patogênicos pertencentes ao gênero Leptospira, família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales. Atualmente, a enfermidade representa uma

Ias zoonoses bacterianas mais frequentes do.......mundo com—mais

le um milhão de novos casos relatados a cada ano. Os

reservatórios..... da.....bactéria compreendem...... tanto animais

domésticos como silvestres. Embora seres humanos possam ser 5 infectados pelo patógeno, o homem é considerado um hospedeiro acidental. A transmissão pode ocorrer diretamente através do contato com os tecidos/urina de animais infectados ou indiretamente através do contato com solo ou água contaminada com o micro-organismo. A 10 proximidade dos reservatórios à fontes de água tais como córregos e canais, oferece um alto risco de infecção aos seres humanos e animais. Dessa forma, períodos de intensa precipitação pluviométrica favorece a ocorrência da enfermidade, devido a maior exposição dos tecidos e mucosas 15 à água contaminada. Em particular, nos países em desenvolvimento, a leptospirose é uma importante zoonose para a saúde pública, uma vez que grande parte da população vive em locais propícios à doença. 0 espectro clínico da leptospirose exibe distintos graus de severidade incluindo 20 febre e dores de cabeça/musculares até os casos mais graves, onde a infecção pode conduzir a hemorragia pulmonar, falha renal/hepática e morte. A presença dos fatores de risco associados a leptospirose, principalmente em países em desenvolvimento como o Brasil, sugerem a

neces s idade do diagnós t ico precoce em humanos / animais de

companhia e a identificação de reservatórios

epidemiológicos.....e ecológicos objetivando o controle da

doença.

5

Do controle da leptospirose

O diagnóstico da leptospirose pode ser baseado no isolamento do patógeno, porém o crescimento das leptospiras em meios de cultura específicos é lento e pode durar até 10 meses para a caracterização do micro-organismo. Assim, a sorologia é atualmente usada para confirmação clínica da leptospirose. Dentre os testes sorológicos, o teste de soroaglutinação microscópica (MAT) é considerado o ensaio de referência no Brasil e no mundo. No entanto, algumas 15 dificuldades são encontradas para a realização do MAT, tais comò a necessidade de uma bateria viva de sorovares de Leptospira para a triagem dos soros de humanos e animais suspeitos e um alto grau de reações cruzadas entre diferentes sorovares, onde muitas vezes o resultado revela 20 títulos elevados de anticorpos para sorovares que não são os causadores da enfermidade ou surto. Por esse motivo, o desenvolvimento de metodologias alternativas como a SIM-PCR e a SIM-CC, pode contribuir para o entendimento da doença e elaboração de testes mais simples e eficientes para a

prevenção.....e........tratamento......da leptospirose. Embora.....NCM .....sejam

comercialmente disponíveis, ainda existe a necessidade de desenvolver materiais e metodologias em solo brasileiro que apresentem vantagens em relação aos produtos importados 5 tais como NCM com alta estabilidade quimica e fisica, fáceis de sintetizar, capacidade de biofuncionalização, propriedades superparamagnéticas e sob custos reduzidos de produção.

10 OBJETIVOS DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como objetivo principal desenvolver uma tecnologia de diagnóstico de leptospirose, a partir de uma metodologia capaz de detectar leptospiras patogênicas. A metodologia aqui descrita aborda a 15 biofuncionalização da superfície dos NCM a base de carbono e cobalto e a avaliação desse material como suporte sólido para o ancoramento de biomoléculas. Para isso, propomos as metodologias de SIM-PCR e SIM-CC para captura das leptospiras a partir de culturas liquidas e identificação 20 do patógeno por protocolos seguros e de rápida execução.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à metodologia de preparo de NCM-C/Co e sua avaliação quanto a capacidade de capturar

leptospiras patogênicas, baseada.....na utilização.....de.........cultivo

in vitro de leptospiras e PCR, como metodologias seguras de avaliação do insumo obtido.

Em particular, a presente invenção refere-se a testes 5 de viabilidade e integridade do micro-organismo pós captura por NCM-C/Co adsorvidos a anticorpos específicos contra leptospiras patogênicas. Além disso, esta metodologia

deverá ser

utilizada

no incremento da detecção

de

leptospiras

patogênicas

ou de sua

maior eficiência

de

10 cultivo in

vi tro em

laboratórios

de bacteriologia

e

imunologia.

Preparação dos NCM-C/Co

Modificação da superfície

15    A modificação da superfície dos NCM-C/Co foi realizada

através do recobrimento com grupos carboxila (- COOH). Para tanto, o precursor orgânico utilizado como fonte dos grupos funcionais citados foi o ácido acrílico (AA) (CH2 = CH -CGOH). Este foi escolhido como agente funcionalizante 20 devido à sua estrutura química e a facilidade que apresenta em se polimerizar na superfície do NCM-C/Co, em virtude da ligação dupla que apresenta em sua cadeia principal. No procedimento, foi utilizada uma solução de 2,9 mol.L-1 AAo, em cujos 4 mL foram embebidas 0,15 g de NCM-C/Co. Nos

primeiros 10 min a disperão formada- -foi deixada em banho

ultrassônico e, após, sob agitação magnética e leve

aquecimento (aproximadamente.......50 °C)........até a..... secagem do

material. Em virtude da polimerização do AA, foi observada 5 aglomeração dos NCM-C/Co funcionalizados (NCM-C/Co-AA), o quais passaram por uma leve maceração, utilizando béquer e bastão de vidro, e sonicação para promover a segregação do material. Por fim, os NCM-C/Co-AA funcionalizados foram analisados por FT-IR (Fourier Transform Infrared

10 Spectroscopy) para detectar a presença dos grupos carboxílicos na superfície dos NCM-AA Co/C-AA e as as propriedades magnéticas verificadas com o auxílio de um magneto. Além disso, a estabilidade dos NCM-C/Co-AA foi determinada por Zetasizer Nano ZS a temperatura ambiente.

15 As medidas acima citadas foram realizadas com 5 mg.mL-1 dos NCM-C/Co-AA dispersos em phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4.

Imòbxlização das bxomoléculas à superfície dos NCM-20 C/Co-AA

Antes da SIM-PCR e SIM-CC foi realizado um ensaio de imunofluorescência para verificar a capacidade de imobilização de biomoléculas na superfície dos NCM-C/Co-AA. Inicialmente 5 mg dos NCM-C/Co-AA foram lavados com PBS

para.......a eliminação.......dos.......residuos deixados pelo processo.....de

síntese e esterilizados a 100 °C por 15 min. A seguir,

proteína A.......recombinante.....(1,2 mg)......de Staphylococcus aureus

foi ligada covalentemente à superfície ativada dos NCM-5 C/Co-AA utilizando solução 1 - ethyl -3 -    (3 -

dimethyaminopropyl) carbodiimide (EDAC) diluída em etanol (40mg/70mL) a 25 °C sob leve agitação durante 3 h. Os NCM-C/Co-AA foram lavados com tampão borato 0,05 M (pH 9,5) e a seguir incubados com 1,2 mg/mL de anticorpos monoclonais 10    (MAb) anti rLipL32 (proteína expressa por leptospiras

patogênicas). Após as amostras foram lavadas com o mesmo tampão e os lavados mensurados por espectrofotometria (280 nm) para confirmar a remoção dos MAbs não ligados covalentemente. A detecção da cadeia de ligações na 15 superfície dos NCM-C/Co-AA foi realizada com anticorpos conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC). A marcação dos NCM-C/Co-AA foi visualizada em microscópio de fluorescência (450 nm). Uma reação controle foi realizada para verificar a especificidade da metodologia. Para tal, 20 os anticorpos conjugados com FITC foram misturados aos NCM-C/Co-AA com PBS.

Separação Imunomagnética

O.....complexo anteriormente.....mencionado contendo 5 mg.inL-1

de NCM-C/Co-AA, previamente adsorvidos com a proteína A e o

MAb......anti LipL32, foi utilizado para.......capturar leptospiras

patogênicas a partir de cultivos puros (108 bactérias/mL 5    até 104 bactérias/mL) e    artificialmente    contaminados com

outros micro-organismos (densidades equivalentes). Após, as leptospiras patogênicas capturadas foram detectadas através de SIM-PCR e SIM-CC. Para a realização da SIM-PCR, o DNA leptospiral imunoseparado foi extraido pela adição de DSS e 10    cloreto de sódio e seguida de fervura    (10 min) . O DNA

extraido foi usado como template na técnica de PCR utilizando primers complementares à região codificadora para a proteina LipL32. Para a realização da SIM-CC as leptospiras patogênicas    imunoseparadas    foram utilizadas

15    como inóculo inicial    em meio liquido Ellinghausen-

McCullough-Johnson-Harris. A SIM-PCR foi capaz de detectar o DNA leptospiral em gel de agarose (1,5 %) em todas os procedimentos revelando bandas de aproximadamente 264 pb, çompativeis com a sequência contida na região codificadora 20 para a proteina LipL32; e a SIM-CC foi capaz de subcultivar em meio especifico de leptospiras patogênicas a partir do meio as quais foram capturadas.

Lista de Abreviaturas

EDAC: 1 - ethyl -3 - (3 - dimethyaminopropyl) carbodiimide MAb: anticorpo monoclonal 5 MAT: teste de soroaglutinação microscópica

PBS:    phosphate buffered saline/tween; tampão fosfato-

salino-Tween

PBS: phosphate buffered saline; Tampão fosfato-salino PCR: reação em cadeia da polimerase 10 SIM: separação imunomagnética

SIM-CC: separação imunomagnética-cultivo celular

SIM-PCR:    separação imunomagnética-reação em cadeia da polimerase

EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente

invenção e .......demonstrar------------claramente__________ os ...... potenciais

biotecnológicos da metodologia aqui descrita, a seguir são apresentados exemplos de possíveis aplicações para esta invenção.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

— Metodologia para o isolamento (SIM—CC) de L&ptospixa spp. a partir de amostras clinicas (sangue e urina) de mamíferos suspeitos com leptospirose

Os NCM-C/Co-AA (5 mg/mL) cobertos com proteína A e MAb anti LipL32 serão usados para capturar o patógeno a partir de amostras clinicas de diferentes mamíferos suspeitos de leptospirose. 0 processo de imunoseparação ocorrerá por 1 h à temperatura ambiente, sob leve agitação, do complexo com as amostras teste. Os contaminantes e os outros microorganismos serão removidos através de lavagens com PBS e o produto imunoseparado utilizado como inóculo inicial em EMJH. Verificações periódicas serão realizadas para identificar o crescimento bacteriano. A contagem celular após a visualização das espiroquetas será realizada em

câmara de...........Neubauer.......Por.....fim,..........o DNA.......presente.....no .....cultivo

celular será avaliado por sequenciamento do gené rpoB. Para

tal,......o DNA será extraido por método de fenol-clorofórmio e