Formulação antisséptica contendo nanopartículas de prata para uso odontológico

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 013996 3 A2
  • Data do depósito:
  • 06/06/2013
  • Data da publicação:
  • 10/11/1987
Inventores:
  • Classificação:
  • A61P 31/00
    Antiinfecciosos, i.e. antibi?ticos, antiss?pticos, quimioterap?uticos;
    ;
    A61K 9/51
    Prepara??es medicinais caracterizadas por formas f?sicas especiais; / Prepara??es em c?psulas, p. ex. de gelatina, de chocolate; / Micro-c?psulas; / Nanoc?psulas;
    ;
    A61K 33/38
    Prepara??es medicinais contendo substâncias ativas inorgânicas; / Metais pesados; Seus compostos; / Prata; Seus compostos;
    ;
    A61K 6/00
    Prepara??es para odontologia;
    ;

RESUMO Patente de Invenção: “FORMULAÇÃO ANTISSÉPTICA CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA PARA USO ODONTOLÓGICO.” A presente patente de invenção refere-se ao uso de nanopartículas de prata, em associação ou não a diferentes compostos químicos, em qualquer tipo de formulação comercial líquida, gel ou pastosa, como potente bactericida e/ou bacteriostático, aplicado na odontologia (endodontia e/ou periodontia), no combate a diferentes tipos de bactérias que contaminam e que são causadoras das principais periapicopatias endodônticas. Nesta patente de invenção, a composição comercial terá como princípio ativo as nanopartículas de prata isoladamente ou em associação, bem como outras nanopartículas de outros metais, isoladas ou em associação, além de derivados, bem como o todo ou a parte em que o ativo bactericida e/ou bacteriostático compreenda formulações de nanopartículas de prata ou outros metais, podendo ainda ser utilizadas de forma pura, em fração ou em associação, obtidas por via química ou microbiológica, com o objetivo de antissepsia do canal radicular.

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Documento

“Formulação antisséptíca contendo nanopartículas de prata para uso odontológico.”

Nos últimos anos, o interesse pelas nanopartículas de prata tem crescido notavelmente, envolvendo uma gama de aplicações na área de 5 desiníecção de materiais médicos, eletrodomésticos, tratamento de água, utilização em curativos tópicos (Lí et aí., 2008), além de aplicações em roupas, cosméticos e instrumentos odontológicos (MARAMBiO-JONÊS; HOEK, 2010),

A utilização das nanopartículas de prata proporciona vantagens em relação â biocompatibílidade e à atividade antimicrobiana quando comparadas 10 aos seus sais precursores (MANDAL et al., 2012). O método mais comum de síntese de solução de nanopartículas de prata é a redução químiGa de um sai de prata, normalmente o nitrato de prata (AgN:03), por um composto redutor, como o boridreto de sódio {NaBH4), cítrato de sódio, glicose, maltose, hídrazina ou ascorbato de sódio (MARTINEZ-CASTANON et ai, 2008; TO LA YM AT et ai, 15    2010) com a utilização de diferentes agentes estabilizantes, como o polivínil-

pirrolídona (PVP) e o poliviníl-álcooí (PVA) (LIN et ai, 2012). A síntese de nanopartículas de prata por meio da redução com açúcares, chamada síntese verde, tem a vantagem de não utilizar compostos químicos tóxicos, como boridreto de sódio, favorecendo a biocompatibílidade e reduzindo a 20 citotoxicidade do produto final,

A formulação aqui proposta será utilizada como antisséptico, Assim, para obter a ação antimicrobiana desejada, as nanopartículas de prata contidas na formulação devem apresentar diâmetro menor que 10 nm, o que permitirá âs mesmas atravessar a parede celular bacteriana. Ao penetrar nas células, as 25 nanopartículas de prata suprimem a respiração dos microrganismos, interferindo na atividade mitoncondrial, impedindo seu crescimento. Além disso, as nanopartículas também podem interagir com o DNA bacteríano, impedindo a reprodução celular (DAM et ai, 2008),

Existem estudos que avaliam a possibilidade da adição de 30 nanopartículas de prata aos cimeníos endodônticos, potencializando a ação antimicrobiana destes. No entanto, a utilização de nanopartículas de prata em formulação intracanal, com finalidade antisséptica de regiões do períápice,

previaraeníe e durante o tratamento endodôntíco é inédita, não existindo paralelo no mercado, na literatura científico-acadêmíca e/ou arquivo de patentes e registros.

O objeto da presente patente de invenção compreende uma formulação contendo nanopartículas de prata com atividade bactericida e/ou bacteriostática para as principais bactérias causadoras das patologias periodontais e periapicaís, auxiliando no tratamento periodontal e endodôntico, A composição química da formulação inclui nanopartículas de prata, a qual pode ser obtida pela síntese a partir de rotas químicas e biológicas, pelo menos um veículo, um agente estabilizante e um solvente, para uso como formulação intracanal, contra bactérias que contaminam o canal radícular, tecidos periodontais, retardando o processo de cura das patologias causadas por essas bactérias.

Existem, no mercado, outros produtos com ação antimicrobiana, à base de hidróxido de cálcio, para os tratamentos endodônticos, porém sem eficácia para uma das principais bactérias responsáveis pelas patologias endodonticas, E, faecaiis (SILVA et al., 2010). A presente invenção, por sua vez, de acordo com os resultados obtidos nos estudos micro biológicas, empregando as principais bactérias causadoras das períapicopatias, apresentou eficácia contra todas as bactérias testadas (Escherichia coii, Pseudomonas a&ruginosa, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans), inclusive o E. faecaiis, tendo a vantagem de eliminar as bactérias por meio de interação das nanopartículas com suas organelas, principalmente com a mitocôndría, suprimindo a respiração celular, ao contrário dos demais produtos hoje disponíveis no mercado, que eliminam as bactérias pela alcalinízação do pH do meio.

Para efeito desta invenção, entende-se por formulação intraeanai, toda e qualquer composição, comercial ou não, que contenha um ou mais princípios ativos com fins de antissepsia de tecidos periapicaís, periodontais, atuando de forma bactericida e/ou bacteriostática, podendo ser administrada na forma líquida, pastosa ou em gel.

As composições bacterícídas e/ou bacteriostátícas de que se trata essa invenção, a princípio, poderíam ser obtidas a partir dos sais, minerais ou compostos de prata (nitrato de prata, nitreto de prata, cloreto de prata, fiuoreto de prata, iodeto de prata, acantita, boleíte, silvanita, acetileto de prata, azida de prata, fulminato de prata, hidróxido de prata, óxído de prata, reativo de Tollens (solução amonical de nitrato de prata), sulfadiazina de prata e telureto de prata) os quais poderíam ser reduzidos a partir de rotas químicas, empregando-se borídreto de sódio, citrato de sódio õu açúcares, ou rotas biológicas, empregando-se fungos, em ambos os casos, com ou sem agentes estabílizantes (MARTINEZ-CASTANON et al., 2008; TOLAYMAT et al., 2010; TOLAYMAT et al,, 2010) LIN et aL, 2012).

Para o desenvolvimento da formulação, foram avaliados diferentes métodos de síntese de nanopartículas de prata.

Foram preparadas seis soluções de nanopartículas de prata (A a F), as quais foram sintetizadas pela adição de nitrato de prata a uma solução de boridreto de sódio, com bureta (soluções A, B, C) e com bomba peristáltíca (soluções D, E e F). As soluções foram sintetizadas em água ultrapura pela redução química do nitrato de prata por borídreto de sódio, na presença de citrato de sódio, empregado como agente estabíiizante, sob agitação e em baixa temperatura (banho de gelo).

Para o preparo da solução A, foram adicionados volumes em uma faixa de 5 a 15 mL da solução de citrato de sódio, cujo intervalo de concentração variou de 2,5x10'3 a 4x10'22 mol/L a um balão de fundo chato, contendo de 5 a 15 mL de boridreto de sódio, cujo intervalo de concentração variou de 6,25x10‘a 0,1 mol/L, O mesmo procedimento foi empregado para preparar a solução B, mas utilizando urna solução de boridreto de sódio com intervalo de concentração menor, de 2,5x1 CT4 a 4* 10'3 mol/L. Um volume na faixa de 5 a 15 mL de nitrato de prata, no intervalo de concentração de 1x10'4 a 1,6x10"3 mol/L, foi adicionado, gota a gota, utilizando-se uma bureta de vidro, com vazão similar para ambas as reações, sob agitação constante, ao abrigo de luz e em banho de gelo. Após o término da adição do nitrato de prata, as soluções resultantes permaneceram sob agitação vigorosa de 5 a 20 min.

Para a síntese das soluções C, D, E e F, foram realizados os mesmos procedimentos descritos anteriormente, porém foi selecionada apenas a solução de boridreto de sódio com faixa de concentração de 6,25x10'3 a

0,1 mol/jL. A adição de nitrato de prata, para obtenção da solução C, foi feita com taureta, mas com vazão lenta. Para obtenção das soluções D, E e F, a adição de nitrato de prata foi feita por uma bomba peristáitica IPC (Ismatec, Feldeggstrasse, Suíça), com vazões controladas de 3,6; 1,8 e 0,9 mL/min, 5 respectivamente, sob agitação constante, em banho de gelo. Após o término da adição do nitrato de prata, a solução resultante permaneceu sob agitação vigorosa.

A reação utilizada para a obtenção da solução de nanopartículas de prata está descrita abaixo:

10    2AgNÜ3 + 2NaBH,j => 2Ag + Hz + BzHe + 2NáN03

A presença de nanopartículas de prata, nas respectivas soluções obtidas, foi verificada por meio da observação da cor amarela, característica dessas nanopartículas.

Durante a reação de síntese, a variação da vazão de adição da solução 15 de nitrato de prata (com bureta e com bomba peristáitica) foi feita para verificar o efeito da vazão sobre o tamanho, a distribuição do tamanho e a morfología das nanopartículas.

A solução de nanopartículas, armazenada em frasco transparente, foi posicionada à frente de um feixe de luz (LASER visível) e, devido à presença 20 de nanopartículas, o caminho do feixe de luz foi evidenciado por refração da luz, efeito que não ocorre em soluções que não possuem nanopartículas (efeito Tyndall).

As soluções de nanopartículas foram caracterizadas por meio de especírofotometria na região do visível. Foi feita uma análise por varredura de 25 comprimento de onda no intervalo de 300 a 700 nm para obtenção do espectro de absorção. Este revelou que havia um máximo de absorbância em torno de 400 nm, indicando a presença de nanopartículas nas soluções, Percebeu-se que, à medida que as vazões utilizadas foram reduzidas, houve uma diminuição dos máximos de absorbância.

30    A caracterização por meio de espalhamento dinâmico de luz revelou a

presença de nanopartículas de prata com tamanhos que variavam no intervalo de 1 a 100 nm, demonstrando a diferença na distribuição do tamanho das nanopartículas em função da alteração da vazão durante a reação de síntese das soluções.

A análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) confirmou a presença das nanopartículas de prata nas soluções e ainda revelou a morfologia 5 esférica e o tamanho compatível com os resultados das outras avaliações de caracterização das nanopartículas encontradas.

A verificação da atividade antimícrohiana das amostras das soluções de nanopartículas de prata foi feita por melo da determinação da concentração ínibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM). Para esse teste, foram utilizadas línhagens-padrão de bactérias catalogadas peia ATCC (American Type Culture Collectfon) e NCTC (National Collecíion of Type Cultures), sendo elas: Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (NCTC 775), Pseudomonas aerugimsa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Streptococcus mutans (ATCC 25175).

^    O preparo dos inócuíos bacterianos, para posterior determinação da

concentração inibitória mínima, foi realizado conforme preconização do National Comitteé for Ctlnical Laboratory Standards, atual Laboratory Standards InstitutQ (CLSI) (NCCLS, 2009) para os testes de microdíluição em placa.

As linhagens bacterianas estavam, inicíaJmente, armazenadas em 20 oriotubos a -80°C em meios de cultura líquidos acrescidos de 15% de giicerol, E. coli, E. faecalis, P. aeruginosa e S. aureus foram ativadas em placas de Petrí contendo meios de cuitura Mülier Hinton (Difco, Detroíd, Mi, EUA) e, para S. mutans, o meio era acrescido de 5% de sangue de carneiro (Agar Sangue).

Cada linhagem bacteriana foi ínoculada pelo método de esgotamento em 25 estrias com a finalidade de se obter o crescimento de colônias isoladas verificar a pureza das culturas. Em seguida, as placas foram incubadas em estufa a 37°C por 24 horas para promover o crescimento das culturas bacterianas.

A partir das colônias isoladas, foram preparadas suspensões 30 bacterianas em solução fisiológica com turbidez equivalentes a 0,5 da escala de Mac Farland, determinada pelo densitômetro Densimat (BioMèrieux, Marcy

!'Etoile, França). A escala 0,5 de MacFarland equivale a aproximadamente 1,5 x 1'0a UFG/mL,

As alíquotas das soluções testadas foram individualmente transferidas para tubos de ensaio esterilizados e diluídas com o meio de cultura Müller 5 Hinton líquido na proporção 1:2, com a finalidade de fornecer nutrientes para possibilitar o crescimento bacteriano, quando este não fosse inibido pelas soluções estudadas.

Para a determinação da Concentração Inibítóría Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em placas de 96 poços, distribuídos entre 12 10 colunas horizontais e 8 linhas verticais, Foram utilizadas placas individuais para cada espécie bacteriana testada, totalizando-se cinco placas.

Em cada placa, foram utilizados controles negativos para cada solução (fileiras G e H) e também para os meios de cultura (coluna 1), com a finalidade de verificar a esterilidade dos mesmos. Foram preparados também controles '15 positivos, os quais continham apenas meios de cultura e inóculos bacteríanos (coluna 12) para testar a viabilidade de crescimento das bactérias. Por fim, foi utilizada como controle dos experimentos, a solução de gluconato de clorexidína a 0,12%. Todos os testes foram realizados em duplicata para verificar a reprodutíbilídade e aumentar a confiabilidade dos resultados obtidos. 20    Em cada poço, nas colunas 2 a 1 f, foi adicionada urna alíquota de 100

pL da solução previamente diluída com meio de cultura Müller Hinton líquido. Posteríormente, na coluna 2, foram adicionados mais 100 pL da mesma solução, homogeneizado e retirado o mesmo volume (100 pL) que foi adicionado na coluna 3; desta também foram retirados 100 pL e transferidos 25 para a coluna 4 e assim, sucessivamente, até a coluna 11, da qual, após a adição dos 100 pL retirados da coluna 9, foram retirados 100 pL e descartados, obtendo-se então uma diluição seriada da solução iniciando-se na proporção de 1:2 até 1:1024.

A suspensão inicia! de cada inócuto baoteríano foi diluída na proporção 30    1;10 em caldo Müller Hinton, para a obtenção de uma suspensão 1,5 x 1Q7

UFG/mL. Em seguida, foram inoculados volumes de 5 pL dessa suspensão nos poços da placa de microdiluição (exceto nos poços de controle negativo), sendo a concentração final de bactérias do teste, aproximadamente 10s ou 10UFG/poço.

Apôs a montagem das placas referentes a cada uma das bactérias testadas, as mesmas foram incubadas a 37°G por aproximadamente 24 horas e, posteriormente, foi feita a determinação da CIM para cada solução frente às diferentes bactérias testadas.

A concentração ínibítória mínima (CIM) é a menor concentração de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visível de bactérias em testes de sensibilidade por diluição em meios de cultura sólidos ou líquidos. Com base nesse princípio, a determinação da CIM foi feita por leitura visual da inibição do crescimento das bactérias em cada poço da placa de mícrodiluição. A leitura visual foi realizada com base na observação da turvação do meio de cultura, quando houve crescimento bacteríano, ou na ausência de turvação, quando não houve crescimento bacteríano em comparação aos controles positivos e negativos, respectivamente. Dessa forma, foi determinada como CIM, o poço com a menor concentração da solução, onde não ocorreu o crescimento baeteriano, ou seja, a menor concentração necessária da solução para inibir o crescimento das bactérias testadas.

A concentração bactericida mínima (CBM) é a menor concentração de um agente antimicrobiano que mata as bactérias em testes de sensibilidade por diluição em meios de cultura sólidos ou líquidos. Para a determinação da CBM, foram levadas em consideração as leituras referentes às CIM de cada solução referente a cada bactéria. Para isso, foram selecionados para os testes de CBM todos aqueles poços onde houve CIM, ou seja, nos poços onde não houve crescimento bacteríano visível. Sendo assim, uma alíquota de 10 pL de cada poço selecionado foi transferida, com auxílio de micropipetador, para meio de cultura Agar Müller Hinton, cujos locais de ínoculação foram previamente demarcados nas placas de petri, identificando a diluição da solução testada e a respectiva bactéria, para posterior leitura da CBM. As placas foram incubadas por 24 h a 37°C e, após este período, foi feita a leitura visual dos resultados de CBM pela presença ou não de colônias bacterianas.