Proteína hsp 83-1 recombinante de leishmania e uso em vacina contra leishmanioses

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 032022 3 A2
  • Data do depósito:
  • 14/12/2012
  • Data da publicação:
  • 28/06/2005
Inventores:
  • Classificação:
  • A61K 39/008
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos de protozo?rios; / Ant?genos de Leishmania;
    ;
    C07K 14/44
    Pept?deos tendo mais de 20 amino?cidos; Gastrinas; Somatoestatinas; Melanotropinas; Derivados dos mesmos; / de animais; de seres humanos; / de protozo?rios;
    ;
    A61P 37/04
    F?rmacos para o tratamento de dist?rbios imunol?gicos ou al?rgicos; / Imunomoduladores; / Imunoestimulantes;
    ;
    C12N 15/30
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, prepara??o ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas de protozo?rios, p. ex. de Plasmodium, Trypanosoma,Eimeria;
    ;

PROTEÍNA HSP 83-1 RECOMBINANTE DE LEISHMANIA E USO EM VACINA CONTRA LEISHMANIOSES. A presente invenção se refere ao antígeno HSP 83-1 recombinante, uma proteína presente em protozoários do gênero Leishmania, e seu uso na produção de vacinas contra leishmanioses para seres humanos e/ou cães. Esse antígeno foi selecionado por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritimos de imunoproteômica e filogenia. A reação de ELISA com anticorpos anti-HSP 83-1 permitiu demonstrar que há reconhecimento da proteína recombinante produzida pelo soro de cães, indicando qie a HSP 83-1 é uma importante candidata a antígeno vacinal contra leishmanioses.

Página de 2

Documento

PROTEÍNA HSP 83-1 RECOMBINANTE DE LEISHMANIA E USO EM VACINA CONTRA LEISHMANIOSES

A presente invenção se refere ao antígeno HSP 83-1 recombinante, uma proteína presente em protozoários do gênero Leishmania, e seu uso na produção de vacinas contra leishmanioses para seres humanos e/ou cães. Esse antígeno foi selecionado por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. A reação de ELISA com anticorpos anti-HSP 83-1 permitiu demonstrar que há reconhecimento da proteína recombinante produzida pelo soro de cães, indicando que a HSP 83-1 é uma importante candidata a antígeno vacinai contra leishmanioses.

Heat shock proteins (HSP) são moléculas altamente conservadas que exercem importante papel no dobramento, montagem de proteínas e translocação de proteínas através de compartimentos celulares. Devido ao fato destas proteínas serem altamente conservados em Leishmania sp, associado ao fato de ocorrer prevalência de mais de uma espécie de Leishmania em áreas endêmicas, o uso destas proteínas como antígeno vacinai poderia gerar uma imunidade protetora contra espécies responsáveis pelas formas cutâneas e visceral da leishmaniose (KAUFMANN S.H.E. Heat shock proteins and the immune response. Immunology Today, v. 11, p. 129-136,    1990).

Adicionalmente, estudos tem demonstrado que estas proteínas possuem efeito mitogênico sobre linfócitos B e esplenócitos, sugerindo que possuem papel proliferativo, o qual poderia ser explorado para estratégias vacinais (RICO, A. I. et al. The heat shock proteins, HSP70 and HSP83, of Leishmania infantum are mitogens for mouse B cells. Cell Stress and Chaperones, v.7, 339-346, 2002),.

Atualmente, são encontrados no estado da arte alguns documentos descrevendo estudos relacionados à família de proteínas HSP 83, principalmente no que se refere ao seu uso no diagnóstico de leishmanioses. Skeiky e colaboradores identificaram que a proteína HSP 83 de Leishmania é um antígeno dominante que contribui para a resposta imunológica específica associada a anticorpos da subclasse lgG4 em pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea difusa, sendo assim um potencial antígeno importante no diagnóstico da infecção por L. amazonensis (SKEIKY, Y. A. W. et al.

Association of Leishmania Heat Shock Protein 83 Antigen and Immunoglobulin G4 Antibody Titers in Brazilian Patients with Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. Infection and Immunity, v. 65, n. 121997, p. 5368-5370,1997).

Já o trabalho de Celeste e colaboradores analisou o uso da proteína HSP 83 recombinante em ELISA para o diagnóstico de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Esta proteína foi reconhecida por anticorpos anti-HSP 83 de L. infantum presentes no soro dos pacientes testados, além de não ter exibido reação cruzada com soro de pacientes manifestando doença de Chagas. Assim, a HSP 83 de L infantum pode ser considerada um bom antígeno para sorodiagnóstico de leishmaniose tegumentar (CELESTE, B. J. etal. Leishmania infantum heat shock protein 83 for the serodiagnosis of tegumentary leishmaniasis. Brazilian Journal of Medicai and Biological Research, v. 37, p. 1591-1593, 2004).

Outro exemplo é o estudo realizado por Angel e colaboradores, no qual o gene de HSP 83 de L. infantum foi clonado e caracterizado molecularmente e avaliado como útil no sorodiagnóstico de leishmaniose canina (ANGEL, S. O. et ai. During canine leishmaniasis a protein belonging to the 83-kDa heat-shock protein family elicits a strong humoral response. Acta Tropica, v.62, p. 45-56, 1996).

Badaro e colaboradores desenvolveram um estudo no qual pacientes com leishmaniose mucosa e apresentando resistência à medicação foram tratados com uma combinação de antígenos, dentre eles HSP 83 de L. braziliensis, cujo reconhecimento pelo soro de pacientes ou por células in vitro já era relatado no estado da técnica. Todos os pacientes tratados apresentaram remissão clínica da doença e permaneceram assintomáticos algum tempo após o término do tratamento, indicando que a terapia com a combinação de determinados antígenos é segura e eficaz (BADARO, R. et al. Immunotherapy for Drug-Refractory Mucosal Leishmaniasis. The Journal of Infectious Diseases, v. 194, p. 1151-1159, 2006)

Entretanto, são escassos os trabalhos que investigam o padrão de expressão desta família de proteínas HSP 83-1 em parasitos do gênero Leishmania no sentido de identificar o potencial destas proteínas como composto imunogênico para vacinas. Apesar da extensiva busca por imunobiológicos mais sensíveis e específicos para vacinas contra leishmanioses, ainda são necessárias melhorias na eficácia dessas vacinas em proteger contra a doença e evitar diagnósticos falso-positivos nos principais hospedeiros envolvidos no ciclo de vida do parasito, quais sejam o homem e os cães. Assim, a presente invenção é apresentada como uma alternativa para solucionar este problema. Trata-se do uso da forma recombinante da proteína HSP 83-1 de Leishmania como antígeno em vacinas contra leishmanioses em cães e/ou humanos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral anti-HSP 83-1 de Leishmania (Viannia) braziliensis e do kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos®) em soro de cães de área endêmica para Leishmaniose Visceral Canina. O eixo X representa os grupos avaliados: cães não infectados (Negativo, n = 51) e cães infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi (Positivo, n = 52). Já o eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. O símbolo (*) significa cut o/f obtido pela curva ROC. O símbolo (#) significa cut off obtido de acordo com a recomendação do fabricante (duas vezes a média do valor obtida para o controle negativo que faz parte do kit de diagnóstico).

A Figura 2 apresenta um gráfico comparando as curvas ROC obtidas da ELISA para HSP 83-1 (A) e do Kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos®) (B). Essas curvas foram utilizadas para determinar o cut off, sensibilidade, especificidade e área abaixo da curva (AUC) da técnica de ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao antígeno recombinante HSP 83-1, presente em protozoários do gênero Leishmania, e seu uso na produção de vacinas contra leishmanioses em seres humanos e/ou cães. Esse antígeno foi selecionado por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. De modo geral, sequências de aminoácidos das proteínas dos parasitos Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana foram obtidas do proteoma predito, a partir do banco de dados GeneDB (http://www.genedb.org), onde foi gerado um sub-banco após a exclusão de pseudogenes e genes parciais.

Em seguida, as sequências de proteínas selecionadas anteriormente foram submetidas à análise de similaridade contra sequências do banco de dados ImmunoneBase (http://bioinf.uta.fi/lmmunomeBase/home.html), o qual contém sequências de proteínas intrinsecamente relacionadas ao sistema imunológico do hospedeiro e/ou à defesa contra patógenos (RANNIKKO, K. et ai. Immunity genes and their orthologs: a multi-species database. International Immunology, v.19, p. 1361-1370, 2007), utilizando o algoritmo BLASTP (Basic Local Aligment Search Tool, Disponível em http://www.genbank.nlm.nih.gov). Proteínas apresentando homologia com proteínas de referência depositadas no ImmunoneBase das espécies Homo sapiens (1375 entradas) e Mus musculus (1181 entradas) foram selecionadas e submetidas ao programa MultiLoc (http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc) para predição de localização celular. Para realizar essa classificação, o programa baseia-se na análise da presença de peptídeo sinal N-terminal, na identificação de domínios conservados, os quais estão presentes em famílias de proteínas com localização celular específica, e na composição de aminoácidos (HÕGLUND, A. et ai. Significantly improved prediction of subcellular localization by integrating text and protein sequence data. Pacific symposium on biocomputing, p. 16-27, 2006).

As sequências destas proteínas selecionadas foram analisadas no software Pfam 24.0 (http://pfam.sanger.ac.uk/), o qual contém um amplo banco de dados de famílias e domínios conservados de proteínas, bem como informações sobre as funções biológicas dessas moléculas (PUNTA, M. et ai. The Pfam protein families database. Nucleic Acids Research, v. 40, p. 290-301, 2012). A partir dessa análise, foi identificada a presença de domínios protéicos potencialmente capazes de atuar como proteínas de interação (“protein-protein interaction”, 917 entradas) nas sequências, servindo então como critério de seleção de proteínas para serem utilizadas nas etapas seguintes do presente trabalho, dentre elas a HSP 83-1. Todas as análises in silico foram realizadas localmente no servidor do laboratório, onde estão instalados os programas supracitados.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, mas de modo não limitante, com os exemplos a seguir.

Exemplo 1: Clonagem da do gene codificador da proteína HSP 83-1

Primers específicos para a amplificação por PCR (Polimerase Chain Reaction) do gene completo da HSP 83-1 foram desenhados (SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2), de forma a amplificar toda a sua região codificadora. Foram inseridos sítios de restrição para Nhel, no primer senso (SEQ ID N°1), e para Hindlll, no primer antisenso (SEQ ID N°2), nas extremidades 5’ para facilitar a transferência dos amplicons entre os vetores de clonagem (pGEM®-T, Promega) e de expressão (pET28a-TEV).

As amplificações por PCR foram realizadas utilizando como molde 20100 ng de DNA genômico extraído de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana, além de tampão de reação comercial, 50-200pM de dNTP, 2-10 ng de cada um dos primers senso (SEQ ID N°1) e antisenso (SEQ ID N°2), e 0,5-1,25 U de Taq polimerase de alta fidelidade, em um volume final de 30-50 pL de reação.

Os amplicons obtidos nas PCRs foram misturados com tampão de amostra de DNA em concentração final de 1X e submetidos à separação em gel de agarose 1%, a 100-200 V, em tampão TAE 1X contendo brometo de etídio.

Após a separação, as bandas com tamanho de 2115 pares de base (pb) foram excisadas do gel. O bloco de agarose contendo os amplicons desejados foi submetido à purificação utilizando um kit comercial. O DNA purificado foi, então, clonado no vetor pGEM®-T, através de incubação por 12-16 horas, a temperatura de 2-8°C, com a enzima T4-ligase, seguindo as instruções do

fabricante. Este vetor possui gene de resistência à ampicilina para seleção de transformantes positivos.

Cerca de 1-10 pL dos sistemas de ligação foram incubados por 5-10 minutos no gelo com 50-100 pL de bactérias Escherichia coli eletrocompetentes da cepa XL1-Blue. Após este período, as amostras foram transferidas para cubetas de 0,1 cm e submetidas a um pulso de 2,00-2,50 kV em um eletroporador. Após a eletroporação, foram adicionados 50-300 pL do meio de cultura 2xYT líquido, seguido por incubação durante 1 hora, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). Após este período, as amostras foram plaqueadas em meio sólido 2xYT-ágar 1,5% com ampicilina (20-100 pg/mL). As placas foram colocadas em estufa durante 12-16 horas, para obtenção de colônias isoladas.

Os clones positivos obtidos foram inoculados em 3-10 mL de meio 2xYT, contendo ampicilina e cultivados durante 12-16 horas, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). A extração dos plasmídeos foi realizada utilizando um kit comercial.

Os plasmídeos contendo os insertos (amplicons) foram submetidos a dupla digestão, durante 12-16 horas, a 30-37°C, com as enzimas de restrição Nhel e Hindlll, cujos sítios específicos estão presentes nas extremidades do amplicon. Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese e o inserto obtido (2115 pb), foi purificado do gel de agarose.

Exemplo 2: Expressão da proteína HSP 83-1 em E. coli

A ligação entre os fragmentos clonados, obtidos por digestão enzimática dos plasmídeos, conforme descrito no exemplo anterior, e o vetor pET28a-TEV, que também foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Hindlll e possui o gene de resistência à kanamicina para seleção positiva dos transformantes, foi realizada através de suas extremidades coesivas, por incubação a temperatura de 2-8°C, durante 12-16 horas, com a enzima T4 Ligase em tampão comercial específico. Após a incubação, o produto de ligação foi utilizado na transformação de bactérias Escherichia coli, cepa BL-21Star, através de eletroporação.

Colônias isoladas de BL-21Star apresentando o plasmídeo pET28a-TEV que contém o gene que codifica a proteína HSP 83-1 foram inoculadas em 3 ou 20 mL de meio 2xYT líquido contendo kanamicina (10-50 pg/mL) e incubadas por 12-16 horas sob a agitação (180-200 rpm). Após este período, os inóculos foram diluídos 1:20 em 10 ou 400 mL de meio 2xYT contendo kanamicina (1050 pg/mL) e incubados a 30-37°C, sob agitação (180-200 rpm) até atingirem densidade óptica (DO600) de 0,6-0,8. Em seguida, a expressão da proteína recombinante foi induzida através da adição de 0,5-1,0 mM IPTG, sendo a cultura, então, incubada por 3-12 horas, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). Finalizado o tempo, a cultura foi centrifugada a 3000-6000 rpm, por 10-30 minutos e a 4°C, o sobrenadante foi descartado e o pellet residual foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C. Alíquotas da cultura imediatamente antes da adição de IPTG, e após 3-12 horas de expressão, foram também congeladas para confirmar a expressão da proteína recombinante.

Os sedimentos celulares mantidos a -80°C foram descongelados no gelo e ressuspendidos em 5-50 mL de PBS para cada 50-500 mL de cultura inicial, na presença de lisozima (20-100 pg/mL), sendo, então, homogeneizados e deixados em repouso por 15-30 minutos. Após o repouso, as alíquotas foram submetidas a 4-5 ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria à 37°C e passadas exaustivamente em seringas de insulina. As amostras foram centrifugadas por 10 a 30 minutos a 10000-14000 rpm, a 4°C, para separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel {pellet). Amostras destas duas frações foram analisadas em eletroforese gel de poliacrilamida-SDS para avaliar em qual fração a proteína recombinante se encontra. Quando a proteína se apresentou insolúvel, foi adicionado ao tampão de ressuspensão 4-8 mol.L'1 de uréia para torná-la solúvel.

O extrato protéico da fração sobrenadante do teste solubilidade foi aplicado em uma coluna HisTrap HP de 1 mL (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi primeiramente lavada com 5 volumes de coluna com o tampão A (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 30mM). A eluição foi realizada através da adição do tampão B (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 500mM). Todas as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.