Composições e métodos para modificar a expressão de genes usando promotor de genes específicos de flor e fruto de plantas

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 015992 9 A2
  • Data do depósito:
  • 28/06/2012
  • Data da publicação:
  • 23/12/2014
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 15/11
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas;
    ;
    C12N 15/82
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Introdu??o de material gen?tico ex?geno usando vetores; Vetores; Utiliza??o de hospedeiros para os mesmos; Regula??o da express?o; / Vetores ou sistemas de express?o especialmente adaptados a hospedeiros eucariotos; / para c?lulas vegetais;
    ;
    A01H 5/00
    Plantas flor?feras, i.e. angiospermas;
    ;
    A01N 63/02
    Biocidas, repelentes ou atrativos de pestes ou reguladores do crescimento de plantas contendo micro-organismos, v?rus, fungos microbiais, animais, p. ex. nemat?ides ou substâncias produzidas por ou obtidas de micro-organismos, v?rus, fungos microbiais ou animais, p. ex. enzimas ou fermentados; / Subst?ncias produzidas por ou obtidas de micro-organismos ou animais;
    ;
    C12N 15/29
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, preparação ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas vegetais, p. ex. taumatina;
    ;

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES USANDO PROMOTOR DE GENES ESPECÍFICOS DE FLOR E FRUTO DE PLANTAS. A presente invenção refere-se a promotores de expressão de genes específicos em plantas. Mais especificamente, a presente invenção proporciona uma sequência de nucleotídeos para a expressão de genes de interesse em flores e frutos de Gossypium Hirsutum para produção de plantas geneticamente modificadas que sejam capazes de resistir ao ataque de pragas, tal como bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Nomeadamente, a presente invenção descreve construções de DNA que contenham os promotores dos genes de interesse, para criação de plantas geneticamente modificadas, bem como um método para modificação da expressão gênica.

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Documento

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES USANDO PROMOTOR DE GENES ESPECÍFICOS DE FLOR E FRUTO DE PLANTAS”

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a promotores de expressão de genes específicos em plantas.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona uma sequência de nucleotídeos para a expressão de genes de interesse em flores e frutos de Gossypium hirsutum para produção de plantas geneticamente modificadas que sejam capazes de resistir ao ataque de pragas, tal como bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis).

Nomeadamente, a presente invenção descreve construções de DNA que contenham os promotores dos genes de interesse, para criação de plantas geneticamente modificadas, bem como um método para modificação da expressão gênica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O algodão é a principal fonte de fibra têxtil e a segunda cultura mais importante de semente oleaginosa do mundo (KHAN et al, 2000). Segundo o Departamento de Agricultura Norte-Americano (USDA) 35% da fibra utilizada mundialmente provêm da cultura algodoeira (http://www.ers.usda.gov/Briefing/Cotton/, em 01/05/2011), sendo que a espécie Gossypium hirsutum é responsável por mais de 95% da produção mundial da fibra (GUO et al, 2008), fatos que tornam essa cultura economicamente importante no que tange a indústria têxtil tanto quanto a agroindústria em geral, devido a extração de óleo para biodiesel.

No Brasil, a cotonicultura vem ganhando cada vez mais importância no agronegócio.

Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Desenvolvimento, as lavouras brasileiras alcançaram o índice de produtividade 60% superior ao dos Estados Unidos, sendo que Mato Grosso e Bahia são os estados responsáveis por 82% da produção nacional e se destacam pelo investimento na área (http://www.agricultura.gov.br/vegetal/culturas/algodao, em 01/05/2011),

Contudo, a produtividade desta cultura ainda enfrenta grande barreira, devido às pragas que ainda são fator limitante.

O bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis) é a praga de maior incidência no cerrado brasileiro e que proporciona os maiores danos (DEGRANDE, 1998).

As fêmeas deste coleóptero ovipositam nos botões florais e maçãs do algodão e as larvas, quando eclodem, se alimentam dos mesmos promovendo sua queda sendo que podem atacar cerca de 50% de botões florais e maçãs de uma plantação de algodão, causando sua inviabilidade na maioria das vezes (RIBEIRO 2007).

O hábito endofítico do bicudo-do-algodoeiro diminui a qualidade da fibra, dificulta o controle químico, e por conseqüência, causa danos econômicos consideráveis.

Dessa forma, o método mais promissor em termos de custo e sustentabilidade para o controle do bicudo-do-algodoeiro é o desenvolvimento de linhagens de algodão, geneticamente resistentes, que possam suprimir o desenvolvimento larval do inseto.

A manipulação de características de uma determinada cultura se tornou possível mediante o advento da biotecnologia e da engenharia genética.

Já é de conhecimento do estado da técnica que diversos genes provenientes do Bacillus thuringiensis (Bt) já foram utilizados para a produção de plantas transgênicas resistentes a uma série de insetos.

A bactéria B. thuringensis, proveniente do solo, forma esporos durante sua fase estacionária de crescimento. Esses esporos contêm cristais formados por proteínas Cry de um ou mais tipos que possuem uma potente e específica atividade inseticida. A toxina Bt é ingerida pelo inseto na forma de pro-toxina que, em contato com o pH alcalino do aparelho digestivo do animal é clivada na sua forma ativa. Uma vez ativada, a toxina se liga a parede do intestino promovendo a abertura de poros. O movimento de solutos através da membrana do tecido epitelial é desbalanceado, causando a morte do inseto (SANAHUJA et al., 2011). Dentre as proteínas Cry, a maioria do tipo-Cry1l quando expressa em um sistema homólogo (por exemplo Bacillus) ou em sistema heterólogo (por exemplo E. coli e planta transgênica) exibe atividade principalmente contra o grupo de insetos Lepidóptera e raramente contra o grupo Coleóptera, o qual pertence o bicudo. No entanto, a descoberta e caracterização de um novo gene, o gene cry1la12, proveniente da cepa S811 de B. thurigiensis tornou-se um potencial agente biotecnológico para o controle desta praga (SANAHUJA et al, 2011). A proteína recombinante deste gene, Cry1la12 , expressa em Escherichia coli demonstrou atividade contra larvas de A. grandis, demonstrando o potencial deste gene para o uso em transgenia, visando o controle deste importante inseto-praga (GROSSI-DE-SÁ et al., 2007). Muitas culturas já foram geneticamente manipuladas para expressarem proteínas Cry no combate a pragas, inclusive algodão (HOFFMANN et al. 1992). Os genes codificantes dessas proteínas foram majoritariamente expressos sob o controle do promotor constitutivo CaMV35S, originalmente isolado do vírus do mosaico da couve-flor.

A linhagem de algodão portando o gene Bt (US7345229) é resistente ao ataque de Heliothis zea, Pecíínophora gossypielta, Heliothis virescensTrichoplusia ni. Apesar de abrangente, tal linhagem não confere resistência ao A. grandis, a principal praga de algodão, destacadamente no Brasil.

Dessa forma, se faz necessária a construção de uma nova linhagem de plantas, dotadas de flores e frutos, resistente ao ataque de insetos e pragas, principalmente a obtenção de uma nova linhagem de algodão, resistente ao ataque do bicudo-do-algodoeiro, um dos objetivos da presente invenção.

O promotor é o principal responsável pelo mecanismo de regulação da expressão de um gene, pois possui sítios de ligação para fatores transcricionais (TF) e para a própria RNA polimerase, responsável pela transcrição do gene. Diversas regiões de promotores, denominadas elementos cis, foram caracterizadas como sítio de ligação de diferentes TFs, dentre elas a mais bem caracterizada é o elemento TATA-box. A pluralidade desses elementos permite a modulação temporal e espacial da expressão de um gene. Poranto, a região promotora consiste em uma importante ferramenta biotecnológica, pois permite o direcionamento da expressão do gene de interesse em uma linhagem transgênica.

Um exemplo dessa aplicabilidade da região promotora seria o uso do promotor com expressão específica em fruto de tomate (W01991001324), para direcionar a expressão de genes capazes de melhorar a composição protéica e o valor nutricional, bem como facilitar a estocagem, manuseamento, cozimento e aspecto do fruto.

Promotores constitutivos como o CaMV35S são capazes de conduzir a expressão de um transgene em todos os tecidos da planta. Entretanto, o seu nível de expressão não é necessariamente semelhante em todas as células vegetais (SUNIKUMAR et al., 2002), há alterações na expressão da proteína ao longo do desenvolvimento da planta. Esse efeito tem sido relacionado ao processo de metilação do promotor durante o desenvolvimento da planta já, que este permanece ativo desde o início do desenvolvimento. Referido resultado tem sido relatado especialmente quando se inicia a fase reprodutiva, quando ocorre o ataque do A. grandis (CHEN et al., 2000). Atém disso, níveis variáveis de expressão são observados em diferentes tecidos apesar de o promotor ser considerado constitutivo. Por exemplo, expressão de Cry1A em ovários de algodão está entre os menores encontrados nos diferentes tecidos do algodoeiro. Isso pode ser especialmente crítico para insetos que atacam esse tecido durante o desenvolvimento, como foi observado para o Hefiothis zea e que também pode ocorre para o A. grandis (KRANTHI et al., 2005). E, finalmente, impactos negativos em insetos náo alvo podem ser minimizados pela diminuição material vegetal expressando Bt, apesar de que até o momento não existe um prova conclusiva de que o algodão Bt pode ter impacto em insetos não alvo (DALEetal., 2002).

Além disso, a expressão constitutiva de uma proteína heteróloga em uma variedade transgênica demanda um alto custo energético para a planta. Outros promotores constitutivos também foram caracterizados em algodão (EP1953231), em café (US6441273), em A. thaliana (US20020115850) e em milho (US6670467).

Dessa forma, o método mais promissor em termos de custo e sustentabilidade para o controle do bicudo-do-algodoeiro é o desenvolvimento de linhagens de algodão geneticamente resistentes que possam suprimir o desenvolvimento larval do inseto.

Com o advento da biotecnologia e da engenharia genética tornou-se possível a manipulação de características de uma cultura economicamente importante como o algodão através da inserção de transgenes. Diversos genes proveninentes do Bacillus thuringiensis (Bt) já foram utilizados para a produção de plantas transgênicas resistentes a uma série de insetos.

Linhagens de plantas geneticamente modificadas para controle de pragas vem sendo amplamente comercializadas no Brasil, contudo, nenhuma das variedades atualmente disponíveis demonstra a capacidade de controlar esse importante inseto-praga, que é considerado um problema, pronunciadamente no Brasil.

As linhagens geneticamente modificadas comercializadas no Brasil fazem uso de proteínas tóxicas com atividade inseticida sob controle do promotor constitutivo CaMV35S. Essa região regulatória é capaz de conduzir a expressão de um transgene em todos os tecidos da planta. Entretanto, o seu nível de expressão não é necessariamente semelhante em todas as células vegetais, variando ao longo do desenvolvimento da planta e nos diferentes tecidos apesar de o promotor ser considerado constitutivo. Também podemos citar possíveis impactos negativos em insetos não-alvo e, por fim, a expressão constitutiva de uma proteína heteróloga em uma variedade transgênica demanda um alto custo energético para a pianta.

Portanto, de acordo com o estado da técnica da presente invenção, verifica-se que sequências regulatórias de três genes específicos de flor e fruto em plantas, mais precisamente em algodão (Gossypium hirsutum) são capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos. Estas sequências promotoras podem ser utilizadas na modificação da transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos na produção de polipeptídeos de interesse, como proteínas tóxicas a insetos, mas ainda não possuem uma descrição ou ensinamentos prévios. Consequentemente, pelos motivos já apresentados nesta descrição, persiste a necessidade de linhagens geneticamente modificadas de algodão que possam ser resistentes ao ataque do bicudo do algodoeiro.

Desta forma, o presente invento pretende apresentar construções de DNA que contenham promotores de genes, que desempenhem função especifica no tecido floral e no fruto de variedades de plantas algodão, para criação de organismos geneticamente modificados, resistentes ao ataque de insetos e pragas, principalmente novas linhagens de algodão, que sejam resistentes ao bicudo do algodoeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção compreende a descrição de sequências regulatórias de nucleotídeos, promotoras da expressão de genes específicos, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Mais especificamente a invenção refere-se a sequências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de algodoeiro, como sendo capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas sequências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos.

Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Figura como um objetivo da presente invenção, sequências de DNA, tais como SEQ 1D NO 1, SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3, como sendo, respectivamente, as sequências regulatórias localizadas a montante 5' de cada um dos genes específicos GhPGFS3, GhPGFS4 e GhPGFS8, em tecidos florais e de fruto de plantas. Refere-se também ao uso destas sequências na forma de vetores de expressão para geração de novas linhagens de plantas transgênicas, células vegetais e protoplastos, com a capacidade de direcionar a expressão do gene de interesse somente em alguns tecidos da planta como tecidos florais e de frutos.

Vantajosamente a presente invenção supera o estado da técnica. Inicialmente com relação ao método provido para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo pela utilização de outro vetor recombinante,

Adicionalmente a presente invenção permite o direcionamento de expressão gênica, como proteínas Cry tóxicas, nos locais específicos do ataque de pragas, o que é de extrema importância para a obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas que confiram a resistência da planta.

Assim, para suprir a falta de promotores, disponíveis no mercado atualmente, eficientes em direcionar expressão em flores e frutos de plantas, mais especificamente em algodão, é que este pedido de patente está sendo direcionado.

Vale ressaltar, novamente, que as sequências regulatórias descritas pelo estado da técnica podem ser utilizadas na nova geração de plantas transgênicas que estão sendo desenvolvidas pela utilização de promotores tecido-específico, como por exemplo, em flores e frutos.

O presente avanço descreve que a construção de DNA que contém o promotor de cada um dos genes específicos de flor e fruto, GhPGFS3, GhPGFS4 e GhPGFS8, é capaz de direcionar a expressão do gene repórter (GUS) de forma bastante elevada em flores e frutos de plantas. Dessa forma estes promotores podem ser utilizados para direcionar outros genes de interesse, como os que codificam proteínas Cry tóxicas para vários grupos de insetos praga, especificamente em tecidos reprodutivos como flores e frutos para a geração de plantas resistentes a insetos praga.

Ademais, as sequências ora propostas se mostraram eficientes também na inibição do ataque de pragas, tais como Broca-dos-Frutos, Lobiopa insularis, (Coleoptera: Nitidulidae), que ataca frutos como morango, tomate, pêssego, goiaba, maçã, laranja, melão e melancia; a vassoura-de-bruxa, doença fúngica típica dos frutos de cacaueiros, ocasionada pelo basidiomiceto Moniliophtora perniciosa; lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda, que ataca predominantemente as maçãs; adultos da lagarta das maçãs, Heliothis virescens, que depositam seus ovos nas folhas e botões florais e lagarta rosada, Pectinophora gossypiella, que atacam botões e flores, causando perda total de maçãs pequenas e dano parcial em maçãs mais velhas.

Por fim, o objeto da presente invenção divulga o uso de regiões promotoras específicas de órgãos florais e frutos que ao serem fusionadas a quaisquer genes codificantes, principalmente os codificantes de proteínas tóxicas, podem ser utilizados para geração de plantas transgênicas resistentes a pragas que atacam culturas durante o florescimento e frutificação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Gráfico adaptado de Genevestigator. Cada ponto retangular exibe o valor do potencial de expressão (EP) de experimentos de microarranjo representado por uma variação de azul. EP é definido como o valor médio absoluto de 1% dos maiores valores de todos os microarranjos do banco de dados do Genevestigator. À direita o total de experimentos de microarranjo que possuem o gene indicado na parte superior da figura. Os genes submetidos a esta análise foram selecionados devido a sua alta expressão no banco de dados do PAVE. Os três genes mostrados foram selecionados para análise de seu padrão de expressão devido à observada expressão em tecidos florais.