Uso de jasmonatos como nematicidas em formulações comerciais

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 005935 5 A2
  • Data do depósito:
  • 16/03/2012
  • Data da publicação:
  • 23/06/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • A01N 37/42
    Biocidas, repelentes ou atrativos de pestes ou reguladores do crescimento de plantas contendo compostos orgânicos contendo um ?tomo de carbono, tendo tr?s liga??es a hetero?tomos com no m?ximo duas liga??es a halog?nio, p. ex. ?cidos ciclopropano carbox?licos; / contendo dentro da mesma estrutura de carbono um grupo carbox?lico ou um tioan?logo ou um derivado dos mesmos e um ?tomo de carbono tendo apenas duas liga??es a hetero?tomos, com no m?ximo uma liga??o a halog?nio, p. ex. ?cidos ceto-carbox?licos;
    ;

A PRESENTE PATENTE DE INVENÇÃO REFERE-SE AO USO DE JASMONATOS DE FORMA PURA OU EM FRAÇÕES E EXTRATOS, ISOLADA OU EM ASSOCIAÇÃO DE SEUS DIFERENTES ANÁLOGOS QUÍMICOS EM QUALQUER TIPO DE FORMULAÇÃO COMERCIAL LÍQUIDA, SEMI-SÓLIDA OU SÓLIDA, COMO POTENTE NEMATICIDA OU NEMATOSTÁTICO, APLICADO NA AGRICULTURA NO COMBATE A DIFERENTES TIPOS DE4 NEMATÓIDES QUE ATACAM DIFERENTES ESPÉCIES DE PLANTAS DE INTERESSE ECONÔMICO. nESTA PATENTE DE INVENÇÃO A COMPOSIÇÃO COMERCIAL TERÁ COMO PRNCÍPIO ATIVO O ÁCIDO JASMÔNICO OU METIL JASMONATO ISOLADAMENTE OU EM ASSOCIAÇÃO, ALÉM DE ISÓSTEROS, SAIS, DERIVADOS OU SOLVATOS, TÃO BEM COMO TODO, PARTE, OU EXTRATO DE PLANTAS, FUNGOS OU ALGAS, EM QUE O ATIVO NEMATICIDA OU NEMATOSTÁTICO COMPREENDA A CLASSE DOS JASMONATOS, PODENDO O JASMONATO AINDA SER INCORPORADO DE FORMA PURA, EM FRAÇÃO OU EM ASSOCIAÇÃO, DE ORIGEM NATURAL OBTIDO POR PURIFICAÇÃO OU ORIUNDO DE VIA SINTÉTICA.

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Documento

USO DE JASMONATOS COMO NEMATICIDAS EM FORMULAÇÕES

COMERCIAIS

Os jasmonatos, cujos representantes são o ácido jasmônico (AJ), seu éster metil jasmonato (MJ), seus isômeros/análogos químicos e alguns dos seus precursores e metabólitos, são reguladores de crescimento vegetal endógenos, da classe das abscisinas (Meyer, et al., 1984, Salisbury; Ross, 1992), envolvidos no controle do metabolismo, desenvolvimento e defesa dos vegetais (Weber et al., 1997). Os jamonatos podem ser obtidos a partir de plantas, fungos, algas ou ainda sinteticamente (Dhandhukia ; Takkar, 2008).

A partir da descoberta dos jasmonatos várias de suas ações têm sido descritas. Considerando indistintamente todos os tipos de jasmonatos, foram reportadas, para estes compostos, ações fitorreguladoras (Koda; Kikuta, 1991), antitumorais (Fingrut; Flescher, 2002; Patente número EP 1379229B1) antifúngicas (Hernandes, 2010), antiparasitárias (Gold et al., 2003; Ofer; Gold; Flescher, 2008), cicatrizante, bacteriostática, analgésica e para aplicação cosmética (Patente número PI0604024-1).

Neste ínterim e a fim de contextualizar o mote deste objeto, os nematodos ou nematóides (filo Aschelminthes e classe Nematoda) são vermes filiformes que podem viver no solo, água doce/salgada e que podem também parasitar plantas e animais. Os nematóides que atacam plantas quase sempre se encontram nas raízes, sendo facilmente encontrados parasitando cafeeiros, algodoeiros, tomateiros, alface, feijão, fumo, citros e outras frutíferas, soja, cana-de-açúcar, entre muitas outras lavouras importantes no Brasil e no mundo, além de diferentes tipos de espécies ornamentais, cultivadas domesticamente ou em larga escala (Flussey; Grundler, 1998). Os nematóides que sejam pragas agrícolas globalmente distribuídas são representados por vários gêneros como Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Helicotylenchus, Pratylenchus, Radopholus, Rotylenchulus, Nacobbus,Tylenchulus, que congregam espécies promotoras da destruição mecânico-química das raízes, levando a desnutrição da planta, diminuição da produção agrícola e aumento de custos com insumos fertilizantes e defensivos. Apesar da extensão de estudos sobre as ações dos jasmonatos, nenhum produto comercial utilizando

partes, todo ou extratos de plantas, fungos ou algas, de diferentes naturezas e origens contendo jasmonatos, ou mesmo considerando os ativos jasmônicos purificados, isolados ou em associação, existe considerando suas ações nematicidas, para aplicação contra nematóides que atacam plantas ornamentais ou de interesse agrícola.

O objeto da presente invenção compreende fornecer composições comerciais padronizadas contendo substâncias com atividade nematicida ou nematostática para nematóides que atacam plantas de interesse econômico. Em um aspecto, as composições comerciais da invenção compreendem padronizados contendo partes, todo, frações purificadas ou extratos de plantas, fungos ou algas, contendo jasmonatos, em diferentes proporções, de forma direta ou indireta, para uso como nematicidas ou nematostáticos, contra nematóides que atacam plantas, sendo o mesmo verdadeiro para os jasmonatos obtidos sinteticamente ou por purificação, de forma pura ou em combinação de diferentes análogos químicos, para o mesmo fim.

Para    efeito desta invenção, entende-se por composições

nematicidas/nematostática, toda e qualquer composição comercial que contenha um ou mais princípios ativos (compostos jasmônicos) com fins profiláticos, paliativos e ou curativos agronômicos, atuando de forma nematicida ou nematostática, podendo ser administrada na forma líquida, seja em soluções aquosas ou em solventes orgânicos, ou mistura de ambos, semi-sólida ou sólida, seja granulados ou pós.

As composições nematicidas de que se trata essa invenção pertencem á classe dos derivados dos jasmonatos ou compostos jasmônicos, seus isosteros, sais, solvatos, e incluem ácido jasmônico, metil jasmonato, jasmona, 7-iso-jasmônico, 9,10-diidrojasmônico, 2,3-dideiidrojasmônico, 3,4-dideiidrojasmônico, 3,7-dideiidrojasmônico, 4,5-dideiidro-7-iso-jasmônico, ácido curcubico, 6-epi-curcubico, 6-epi-curcubico-lactona, 12-hidroxi-jasmônico, 12-hidroxi-jasmônico-lactona, 11-hidroxijasmônico, 8-hidroxi-jasmônico, homo-jasmônico, dihomo-jasmônico, 11-hidroxi-dihomo-jasmônico, 8-hidroxi-dihomo-jasmônico, ácido tuberônico, Ácido tuberônico-O-p-glicopiranosídico, ácido curcubico-0-(3-glicopiranosídico, 5,6-didehidrojasmônico, 7,8-didehidrojasmônico, cis-jasmona, metildihidroisojasmonato, dihidrojasmona, aminoácidos conjugados ao ácido jasmônico, tão bem como alquil

ésteres e estereoisômeros. Estes derivados contém a fórmula (CH2)nCORi, onde n é 0, 1 ou 2; R-i é OH, alcoxi, O-glicosil ou imino; R2 é OH, O, alcoxi ou O-glicosil; R3, R4 ou R5 são H, OH, alcoxi ou O-glicosil; ou ainda radicais Rt e R2 juntos formando a lactona, as ligações entre C3: C7, C4:C5 e Cg:Cio podem ser simples ou duplas ligações; um derivado desta fórmula, que contenha pelo menos uma das seguintes variações: um grupo acil abaixo da posição C3 (ácido livre, éster ou conjugado), um ceto ou hidroxi (hidroxi livre ou éster) umedecido o C6, ou um n-pentenil ou n-pentil na posição C3 (Figura 1).

Para os bioensaios nematicidas utilizou-se sub-populações de Pratylenchus zeae e Helicothylenchus spp, como modelos de nematóides que atacam plantas, os quais foram separadamente multiplicados “in vitro” utilizando-se pequenos cilindros de cenouras (4,0 x 2,0 cm). Inicialmente realizou-se a desinfecção do material, lavando as cenouras com detergente e água corrente, mergulhando-as em seguida em solução de hipoclorito de sódio 0,05% (v/v) por 30 minutos.

Após secagem, na câmara de fluxo laminar, as cenouras foram cortadas em grandes porções, sendo cada fragmento mergulhado em álcool comercial e rapidamente flambado, depois perfurado ao centro com o auxílio de um furador de meio, retirando assim o cilindro de aproximadamente 4,0 x 2,0 cm. Tais cilindros de cenoura foram armazenados em recipientes de vidro com tampa, previamente autoclavados, e então acondicionados por 03 a 04 dias em incubadora tipo B.O.D. a 25°C e aproximadamente 40% de umidade até a inoculação dos nematóides.

Para inoculação, os nematóides provenientes de culturas pregressas do laboratório foram agrupados em recipientes especiais e acrescidos de ampicilina (0,1%, p/v) por 10 minutos. Retirou-se então o excesso de antibiótico e adicionou-se novamente água estéril por 05 minutos, seguido da retirada da água e nova imersão em solução de ampicilina (0,1%, p/v) por mais 10 minutos. Na câmara de fluxo laminar, substituiu-se novamente o antibiótico pela água estéril, coletando-se os nematóides e aplicando-os na extremidade superior do cilindro de cenoura previamente preparados.

Ao final do procedimento o material foi levado para incubação em B.O.D. a 25°C e umidade aproximada de 40% pelo período de 03 meses, onde nova safra de nematóides foi obtida.

Os nematóides extraídos dos cilindros de cenouras foram utilizados tanto para os bioensaios “in vitro”, descritos abaixo, quanto para a reinoculação de novos cilindros de cenoura para manutenção da cultura em laboratório. Nestes casos, o tempo médio de incubação foi de 90-100 dias, o que corresponde ao quarto estágio de desenvolvimento dos nematóides em teste.

O cilindro de cenoura contendo os nematóides foi acrescido de água destilada em quantidade suficiente e submetido à homogeneização em liquidificador comum. O homogeneizado foi filtrado por um conjunto de tamises sobrepostos (60 e 500 mesh, aberturas de 0,250 e 0,025 mm, respectivamente). Os nematóides coletados em suspensão aquosa do tamis de malha menor foram acrescidos de Caulim a 0,1% (p/v) e centrifugados a 1750 rpm por 5 minutos à 25°C. Descartou-se o sobrenadante e homogeneizou-se o precipitado em solução de sacarose 53,3% (p/v), seguido de nova centrifugação a 1750 rpm, agora por 1 minuto (25°C), e filtração em tamis (500 mesh) lavado com água destilada. A suspensão contendo os nematóides axenizados foi então transferida para recipientes adequados, e mediante o auxílio de lupa e estilete apropriados os nematóides foram transferidos para recipientes contendo água estéril.

Para os bioensaios foram constituídos grupos controles positivos/ negativos e experimentais, contando cada um destes grupos com 20 nematóides por recipiente especial de vidro transparente, tipo BPI. Os experimentos foram repetidos por três vezes para cada concentração de AJ e MJ e para cada tipo de nematóide separadamente (P. zeae e Helicotylenchus spp) em esquema de duplo-cego. Como controle positivo fez-se uso de solução de Carbofuran (Furandan®) na concentração de 700ppm, e para controle negativo, fez-se uso de água destilada estéril.

Os jasmonatos (AJ e MJ) foram utilizados nas concentrações finais de 50 ppm, 25 ppm e 12,50 , 6,25 ppm e 3,125 ppm, mantendo-se a escala geométrica. A ação nematicida das substâncias de interesse foi avaliada após 12h e 24h de exposição, sendo considerados mortos os nematóides sem mobilidade. Os valores

de DL-50 foram calculados graficamente. A análise estatística dos dados foi feita pelo teste ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, sendo considerado *p<0.05. **p<0,01.

As figuras 2A e 2B, mostram o efeito nematicida do ácido jasmônico (AJ) em diferentes concentrações (3,125 - 50 ppm) sobre os nematóides modelos P. zeae e Helicotylenchus spp, respectivamente após 12 (2A) e 24 horas (2B) de exposição ao ativo, além de mostrar os resultados obtidos para controles negativos e positivos. Nestas figuras, é possível observar o correto funcionamento do teste, uma vez que a água destilada (controle negativo) causou baixa mortalidade aos nematóides (máximo de 10-20% de morte após 12 ou 24h de observação; 2A e 2B), enquanto o Carbofuran (controle positivo), causou elevado índice de morte (cerca de 75-85% de morte após 12 ou 24h de observação; 2A e 2B). As figuras 2A e 2B mostram elevados índices de mortalidade causados aos nematóides modelos P. zeae e Helicotylenchus spp após 12 (2A) e 24h (2B) de exposição a diferentes concentrações de AJ. Para o nematóide P. zeae as taxas de mortalidade causadas pelo AJ (3,125 - 50 ppm) chegaram a um máximo de cerca de 66% (50 ppm) após 12 h de exposição (2A). Após 24h e para este mesmo nematóide as taxas chegaram a ser de cerca de 78% de mortalidade na concentração de 50 ppm (2B). Para o Helicotylenchus spp, os resultados foram também promissores. As taxas de mortalidade causadas pelo AJ (3,125 - 50 ppm) chegaram até cerca de 45% (6,25 ppm) após 12 h de observação (2A) e 85% (50ppm) após 24 hs (2B).

As figuras 3A e 3B, mostram o efeito nematicida do Metil Jasmonato (MJ) em diferentes concentrações (3,125 - 50 ppm) sobre os nematóides modelos P. zeae e Helicotylenchus spp, respectivamente após 12 (3A) e 24 horas (3B) de exposição ao ativo, além de mostrar os resultados obtidos para controles negativos e positivos. Nestas figuras, assim como nas figuras 2A e 2B, é possível também observar o correto funcionamento do teste, uma vez que a água destilada (controle negativo) causou baixa mortalidade aos nematóides (máximo de 10-15% de morte após 12 ou 24h de observação; 3A e 3B), enquanto o Carbofuran (controle positivo), causou elevado índice de morte (cerca de 95-100% de morte após 12 ou 24h de observação; 3A e 3B). As figuras 3A e 3B mostram elevados índices de mortalidade

causados aos nematóides modelos P. zeae e Helicotylenchus spp após 12 (3A) e 24h (3B) de exposição a diferentes concentrações de MJ. Para o nematóide P. zeae as taxas de mortalidade causadas pelo MJ (3,125 - 50 ppm) chegaram a um máximo de cerca de 48% (25 ppm) após 12 h de exposição (3A). Após 24h e para este mesmo nematóide as taxas chegaram a ser de cerca de 60% de mortalidade na concentração de 50 ppm (3B). Para o Helicotylenchus spp, os resultados foram também promissores. As taxas de mortalidade causadas pelo MJ (3,125 - 50 ppm) chegaram até cerca de 66% (12,5 ppm) após 12 h de observação (3A) e 71% (12,5 ppm) após 24 hs (3B).

Estes resultados em conjunto confirmam a atividade nematicida dos compostos jasmônicos ou jasmonatos.

REFERÊNCIAS:

Documento de Patente do Brasil:

0604024-1- Velini et al„ 2008 Documento de Patente Europeu:

1379229B1- Flescher; Fingrut, 2002.

DHANDHUKIA, P.C.; THAKKAR, V.R. Response surface methodology to optimize the nutritional parameters for enhanced production of jasmonic acid by Lasiodiplodia theobromae. Journal of Applied Microbiology, v.105, p.636-643, 2008.

FINGRUT, O.; FLESCHER, E. Plant stress hormones suppress the proliferation and induce apoptosis in human câncer cells. Leukemia, v.16, p. 608-616, 2002.

GOLD, D.; PANKOVA-KHOLMYANSKY, I.; FINGRUT, O.; FLESCHER, E. The Antiparasitic Actions of Plant Jasmonates. J. Parasitol, v. 89, n.6, p..1242-1244, 2003.

HERNANDES, C. 2010, 85f. Avaliação in vitro de potenciais atividades biológicas de Jasmonatos e de extrato e frações produzidos por Botryosphaeria rhodina. Dissertação Mestrado Biotecnologia, Universidade de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2010.

HUSSEY, R. S.; GRUNDLER, F.M.W. Nematode parasitism of plants. Physiology and Biochemistry of Free-Living and Plant-Parasitic Nematodes - CAB International Press, p. 213-243 (1998).

5 KODA, Y.; KIKUTA, Y. Possible involviment of Jasmonic Acid in tuberization of yam plants. Plant Cell Physiology, v.32, p.629-633, 1991.

MEYER, A.; MIERSCH, O.; BUTTNER, C.; DATHE, W.; SEMBDNER, G. Ocurrence of the plant growth regulators jasmonic acid in plants. J. Plant Growth Regul. v. 3, p. 1-8, 1984.

10 OFER, K.; GOLD, D.; FLESCHER, E. Methyl jasmonato induces cell cycle block and cell death in the amitochondriate parasite Trichomonas vaginalis. International Journal for Parasitology, v. 38, p.959-968, 2008.

SALISBURY, F.B.; ROSS, C.W. Plant Physiology. Wasdworth Publishing Company, Four Edition, Califórnia, USA, 1992.

15 WEBER, H.; VICK, B.A.; FARMER, E.E. Dinor-oxo-phytodienoic acid: a new hexadecanoid signal in the jasmonate family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v.94, p. 10473-10478,1997.

REINVINDICAÇÕES

USO DE JASMONATOS COMO NEMATICIDAS EM FORMULAÇÕES COMERCIAIS

1.    Uso, como nematicida ou nematostático, de uma composição comercial caracterizada por compreender:

-    pelo menos, 3,125 ppm de ácido jasmônico ou metil jasmonato isoladamente ou em associação, tão bem como de análogos químicos previstos nesta patente, além de isósteros, sais, derivados ou solvatos, tão bem como todo, parte, ou extrato de plantas, fungos ou algas, em que o ativo nematicida compreenda a classe dos jasmonatos, podendo o jasmonato ainda ser incorporado de forma pura, em fração ou em associação, de origem natural obtido por purificação ou oriundo de via sintética.

2.    Uso, como nematicida ou nematostático, da substância ativa isolada ou em associação caracterizada pela fórmula geral (Figura 1).

3.    Uso, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada por a referida substância ser usada como nematicida e/ou nematostático.

4.    Composição comercial como nematicida ou nematostático caracterizada por compreender:

-    pelo menos, 3,125 ppm de ácido jasmônico ou metil jasmonato isoladamente ou em associação, tão bem como de análogos químicos previstos nesta patente, além de isósteros, sais, derivados ou solvatos, tão bem como todo, parte, ou extrato de plantas, fungos ou algas, em que o ativo nematicida compreenda a classe dos jasmonatos, podendo o jasmonato ainda ser incorporado de forma pura, em fração ou em associação, de origem natural obtido por purificação ou oriundo de via sintética.

5.    Composição comercial líquida, semi-sólida ou sólida, caracterizada por compreender um veículo químico-farmacêutico aceitável e pelo menos uma substância caracterizada pela fórmula geral (Figura 1)

6.    Composição, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizada por a referida substância(s) ser usada como nematicida ou nematostática.

-1/3-



9    10    12


(CH2)nCOR,


A)



A)


Tratamentos com Metiljasmonato (MJ) (ppm)



RESUMO

A presente patente de invenção refere-se ao uso de jasmonatos de forma pura ou em frações e extratos, isolada ou em associação de seus diferentes análogos químicos em qualquer tipo de formulação comercial líquida, semi-sólida ou sólida, como potente nematicida ou nematostático, aplicado na agricultura no combate a 5 diferentes tipos de nematóides que atacam diferentes espécies de plantas de interesse econômico. Nesta patente de invenção a composição comercial terá como princípio ativo o ácido jasmônico ou metil jasmonato isoladamente ou em associação, tão bem como de análogos químicos previstos nesta patente isolados ou em associação, além de isósteros, sais, derivados ou solvatos, tão bem como 10 todo, parte, ou extrato de plantas, fungos ou algas, em que o ativo nematicida ou nematostático compreenda a classe dos jasmonatos, podendo o jasmonato ainda ser incorporado de forma pura, em fração ou em associação, de origem natural obtido por purificação ou oriundo de via sintética.