Processo de síntese de fenolftaleína bisfosfato tetrassódio e kit

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2013 023221 1 A2
  • Data do depósito:
  • 11/09/2013
  • Data da publicação:
  • 11/08/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/50
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos;
    ;
    C07F 9/655
    Compostos contendo elementos dos Grupos 5 ou 15 da Tabela Peri?dica; / Compostos de f?sforo; / Compostos heteroc?clicos, p. ex. contendo f?sforo como um hetero?tomo do anel; / tendo ?tomos de oxig?nio, com ou sem ?tomos de enxofre, sel?nio ou tel?rio, como os ?nicos hetero?tomos do anel;
    ;

PROCESSO DE SÍNTESE DE FENOLFTALEÍNA BISFOSFATO TETRASSÓDIO E KIT. A presente invenção refere-se a um processo de sintese do composto fenolftaleína bisfosfato tetrassódio utilizando trietilamina.Mais especificamente, o composto da presente invenção permite a identificação in loco da enzima fosfatase ácida, presente em manchas de sêmen, aplicável a casos de denúncias de crimes de estupro

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Documento

“PROCESSO DE . SÍNTESE DE FENOLFTALEÍNA BISFOSFATO TETRASSÓDIO E KIT”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de síntese do composto fenolftaleína bisfosfato tetrassódio.

Mais especificamente, o composto da presente invenção permite a identificação in loco da enzima fosfatase ácida, presente em manchas de sêmen, aplicável a casos de denúncias de crimes de estupro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em casos de crime de estupro, onde não há testemunhas, a detecção da presença de sêmen humano é um fator de grande auxílio nas investigações forenses para confirmar a natureza do crime, que associadas aos exames de corpo delito e análises laboratoriais para verificar no material coletado no corpo da vítima, contendo a presença do gameta masculino íntegro e por último a confirmação do pressuposto agressor indicado pela vítima através do exame de DNA desse material obtido. A coleta de material na região genital feminina ou mesmo região anal ou em seu entorno, para verificação da presença de sêmen, pode incluir também a investigação através de análises bioquímicas baseadas na detecção de metabólitos oriundos do líquido seminal, tais como: o aminoácido colina, a prostaglandina-E e o elemento zinco, este fartamente encontrado no líquido seminal, assim com a detecção da atividade enzimática dentre elas a enzima gama glutamil-transpepidase e a enzima fosfatase ácida.

A identificação de manchas seminais é frequentemente de grande valor na prática médico-legal, particularmente em casos de estupro, agressão sexual, homicídio sexual ou até mesmo no adultério. Um dos objetivos principais das investigações de ofensas sexuais em laboratórios forenses é analisar as manchas ou quaisquer outros materiais biológicos retirados tanto do agressor como da vítima ou ainda analisar manchas encontradas em tecidos, forros, ou qualquer outra possível evidência sobre o delito para verificar a presença de sêmen, com a finalidade de provar o crime e oferecer à justiça subsídios para condenação do réu (DU MONT, PATNIS; 2000).

As técnicas bioquímicas mais recomendadas para a análise de rotina forense nos casos de estupro incluem a verificação citológica da presença do gameta masculino íntegro, a atividade da enzima fosfatase ácida (APA) e mais recentemente a detecção da enzima PSA.

Notadamente, um teste de grande importância para localização e caracterização da mancha seminal, inclui a detecção da enzima fosfatase ácida prostática.

A fosfatase ácida é uma enzima que é segregada pela glândula da próstata no fluído seminal e está presente em todas as porções do ejaculado. Suas concentrações no fluído seminal são até 400 vezes maiores do que os encontrados em qualquer outro fluído corporal.

Este teste é útil para a identificação de manchas seminais, na ausência de espermatozóides, uma vez que o número de indivíduos com aspermia está aumentando devido à popularização das cirurgias de vasectomia e, além disso, os indivíduos com oligospermia e azoospermia são os mais prevalentes nos casos de crimes de abuso sexual se comparado com homens adultos férteis normais (SAFERSTEIN; 2001) (McCLOSKY, MUSCILLO, NOORDEWIER; 1975).

O teste da fosfatase ácida parece ser um ensaio mais fiável para a caracterização de uma mancha seminal em casos de estupro, porque mesmo em casos de ejaculações em indivíduos que apresentam quadro de aspermia o teor da enzima fosfatase ácida darão resultados comparativamente tão elevados quanto a indivíduos sexualmente saudáveis (BRAUNER,GALLILI;1993).

Alguns reagentes podem ser empregados na detecção qualitativa e na determinação quantitativa da enzima fosfatase ácida. Todos esses reagentes atuam de forma semelhante, são basicamente moléculas utilizadas como indicadores de pH que sofrem alteração em sua forma estrutural conforme o pH do meio assumindo uma forma íôníca geralmente cromofóra. Essas substâncias são modificadas em suas estruturas possuindo um ou mais grupamentos fosfato ligados a um átomo de oxigênio na parte fenólica da molécula sendo essas ligações estáveis e sofrendo ruptura seletiva através da ação da enzima fosfatase ácida liberando a espécie química fosfato PO43' ou HP042' e o indicador na em sua forma iônica que geralmente apresentam cor definida para um determinado valor ou faixa de pH.

Os reagentes mais comuns utilizados para determinação da enzima fosfatase ácida são a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio, a timolftaleína monofosfato dissódio e o a naftil amina monofosfato dissódio, todas essas substâncias são derivados fosfatados de indicadores clássicos para determinação de pH, geralmente empregados na forma de sal sódico para favorecer a solubilidade em água, solvente normalmente utilizados em análises biológicas.

Desses reagentes, o manuseio com a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio se mostra mais eficiente pela facilidade de visualização que vai do incolor enquanto tamponada em pH = 5 indo diretamente a forma iônica desse indicador que apresenta coloração rósea para pH 8,3 quando na presença de um agente corante, no caso uma solução de uma base inorgânica, pela baixa toxicidade da fenolftaleína liberada no meio, pelo baixo custo desse reagente se comparado aos outros utilizados.

Neste processo são necessárias duas etapas de purificação, devido a utilização da piridina. Na primeira etapa parte da piridina é eliminada na etapa de tratamento do produto tetraclorado com água e a segunda etapa consiste em extrações sucessivas com éter etílico até a completa remoção deste reagente tóxico.

Ainda, o grupo de pesquisa da presente invenção realizou esta síntese proposta pelo estado da técnica, encontrando rendimentos menores do que 10% do produto desejado.

Em continuidade, referido processo não aborda nenhum tipo de formulação contendo fenolftaleína bisfosfato tetrassódio útil na detecção da enzima fosfatase ácida.

A patente norte americana US3,331,857 descreve um processo de síntese de ácido monofosfórico de fenolftaleína também úteis na determinação de fosfatase ácida.

Ainda, o documento US2999793 descreve preparação seca para a determinação de fosfatases compreendendo um metal alcalino ou sal de metal alcalino terroso de fosfato de fenolfetaleína e um tampão para manter o pH de 9-11.

O composto fenolftaleína bisfosfato tetrassódio é obtido por uma rota clássica proposta por Huggins e Talalay em 1945. O grande inconveniente deste processo é o uso de piridina como base, pois este reagente apresenta uma elevada toxicidade, além de fornecer um produto final com grandes concentrações de etóxido de sódio, uma condição que inviabiliza a utilização deste produto na avaliação quantitativa da fosfatase ácida em várias aplicações forenses, tais como: em cenas de crimes de estupro, quantificação de sêmen em amostras desta matriz biológica em bovinos, equinos, suínos, caprinos e larvas de insetos, como por exemplo, moscas do tipo varejeira da espécie Chrysomia albiceps, etc.

Persiste assim, uma demanda por nova rota sintética para o composto fenolftaleína bisfosfato tetrassódio, em que seja possível a redução dos níveis de toxicidade e com bons rendimentos e economicamente viável.

SÚMARIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de síntese de fenoftaleína bisfosfato tetrassódio utilizando trietilamina, útil na identificação in loco da enzima fosfatase ácida, presente em manchas de sêmen, aplicável a casos de denúncias de crimes de estupro.

O processo da presente invenção é capaz de gerar um produto final com pureza superior e ainda se mostra economicamente viável uma vez que utiliza reagentes comercialmente disponíveis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Síntese da Fenolftaleína bisfosfato tetrassódio (I).

Figura 2 - Espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio da fenolftaleína bisfosfato tetrassódio comercialmente obtida da Sigma Aldrich Co.

Figura 3 - Espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio da fenolftaleína bisfosfato tetrassódio sintetizada e purificada pela processo da presente invenção.

Figura 4 - Espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 da fenolftaleína bisfosfato tetrassódio comercialmente obtida da Sigma Aldrich Co.

Figura 5 - Espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 da fenolftaleína bisfosfato tetrassódio sintetizada e purificada pela processo da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de síntese de fenoftaleína bisfosfato tetrassódio utilizando trietilamina.

Este processo apresenta um alto rendimento e pureza bem superior aos métodos propostas pela técnica anterior, os quais não abordam o rendimento e tampouco a pureza do produto obtido.

Os reagentes empregados na rota original publicada por Huggins e Talalay em 1945, são de alta toxidez, apresentando o produto final com muitas impurezas agregadas. O produto comercial apresentou um teor de impurezas de aproximadamente 20%.

Vantajosamente o método descrito nesta invenção é capaz de produzir o reagente fenolftaleína bisfosfato tetrassódio, com rendimentos de 75%, apresentando uma elevada pureza.

Neste mesmo contexto, a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio sintetizada neste trabalho, sob a forma de um padrão analítico não contém etóxido de sódio, uma condição que viabiliza a utilização deste produto, na avaliação quantitativa da fosfatase ácida em várias aplicações forenses, tais como: em cenas de crimes de estupro, quantificação de sêmen em amostras desta matriz biológica em bovinos, equinos, suínos, caprinos e larvas de insetos, como por exemplo moscas do tipo varejeira da espécie Chrysomia albiceps, etc

O processo da presente invenção baseia-se na reação da fenolftaleína com trietilamina e oxicloreto de fósforo, sendo descrito em termos gerais pelas seguintes etapas:

(i)    Mistura de fenolftaleína com oxicloreto de fósforo e

diclorometano;

(ii)    Adição de trietilamina à mistura reacional;

(iii)    Evaporação de diclorometano;

(iv)    Adição de hidróxido de sódio;

(v)    Acidificação da solução;

(vi)    Adição de etóxido de sódio;

(vii)    Purificação.

(viii)    Re-precipitação

A reação é conduzida a no máximo 4°C. Contudo, apesar da baixa temperatura a mistura reacional vantajosamente não apresenta alta viscosidade.

De forma geral o processo de síntese da presente invenção é realizado de acordo com o procedimento abaixo evidenciado.

Procedimento Experimental

Em um bécher de 50 g, foram pesadas 8,0 gramas de fenolftaleína, com auxílio do funil para sólidos a massa foi transferida para o interior de um balão tritubulado imerso em banho de gelo triturado e sal grosso.

A seguir foram adicionados 12,5 mL de diclorometano e 6,3 mL de oxicloreto de fósforo. A mistura reacional contendo fenolftaleína com o diclorometano foi submetida a uma forte agitação obtendo-se nesta fase uma suspensão uniforme.

Um funil.de adição a pressão constante contendo 6,3 mL de trietilamina foi acoplado ao balão tritubulado, em seguida foram adicionados, de modo que a temperatura da reação não ultrapassasse 4°C.

A reação deve ser mantida sob agitação a no máximo 4°C por

um período de 6 horas.

O progresso da reação pode ser avaliado, recolhendo-se pequenas alíquotas da mistura reacional, gotejamento em uma placa de toque seguida da adição de pequenas quantidades de uma solução de NaOH 10%.

Enquanto esse teste apresentar coloração rósea, a reação foi mantida em repouso e temperatura ambiente, este teste deve ser repetido se observado um resultado negativo, ou seja, incolor frente à solução de NaOH 10%.

A próxima etapa foi à retirada do diclorometano por evaporação, em seguida foram adicionados 100 mL de água destilada gelada em torno de 4°C, com agitação constante.

Após toda a liberação de vapores de HCI, é observada a formação de uma massa precipitada amarelada semelhante ao âmbar.

A etapa seguinte consistie em adicionar sob agitação solução de NaOH 40% até que todo o precipitado fosse ressolubilizado e a solução pode assumir coloração levemente rósea, devido à pequena quantidade de fenolftaleína não reagida. Essa solução foi filtrada com carvão ativado.

O próximo passo consiste em acidificar a solução aquosa (de fenolftaleína bisfosfato), com um ácido mineral a pH 1,00, preferencialmente HCI concentrado, pH fortemente ácido, pH 1,00 verificado com papel indicador universal Merck, haverá a precipitação da fenolftaleína bisfosfato ácida, como uma massa que lembra goma de mascar de coloração parda.

A seguir a massa foi separada do líquido sobrenadante e num bécher de 250 mL, toda a massa de fenolftaleína bisfosfato ácida foi dissolvida com a menor quantidade de metanol Vetec grau P.A recém destilado possível, adicionando algumas gotas de formamida Vetec grau P.A para aumentar a solubilidade, a quantidade da formamida é empírica.

Foi adicionada solução de etóxido de sódio 1,0 mol.L-1, sob agitação até que toda a precipitação fosse concluída.

O precipitado de fenolftaleína bisfosfato tetrassódio foi

separado por filtração.

A fenolftaleína bisfosfato tetrassódio foi lavada repetida vezes com pequenas porções de álcool etílico e depois com éter seco, esta sequência foi repetida até que o sólido estivesse quase seco.

A fenolftaleína bisfosfato tetrassódio, foi dissolvida com a menor quantidade possível de metanol/formamida (5:1) e a seguir foi adicionado lentamente etanol para re-precipitar a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio purificada. Após separação por filtração a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio foi mantida em dessecador a vácuo.

Ao ser mantida em local seco, escuro e refrigerado, nestas condições a fenolftaleína bisfosfato tetrassódio se mantém estável.

Adicionalmente, este invento provê um kit contendo fenolftaleína bisfosfato tetrassódio, útil na identificação e quantificação de enzima fosfatase ácida.

O composto obtido pelo processo da presente invenção atua quimicamente quando posto em contato com a enzima fosfatase ácida em condições apropriadas, mediante a divagem das ligações P-O, liberando no meio quantidade equimolar de indicador que é diretamente proporcional a atividade da enzima, fato que permite determinar quantitativamente por técnicas instrumentais de espectrometria ótica (absorção do cromóforo formado no UV ou no visível) o teor de enzima no meio.

A fenolftaleína bisfosfato tetrassódio exibe uma facilidade de visualização que vai do incolor, enquanto tamponada em pH = 5, à coloração rósea para pH 8,3 quando na presença de um agente corante, no caso uma solução de uma base inorgânica.

Assim, a presente invenção utiliza como solução reveladora a solução de hidróxido de amônio 1,0 mol.L-1 que apresenta além da capacidade de promover caráter básico suficiente para a obtenção da forma iônica cromófora da fenolftaleína, após ter identificado em amostras de tecidos de roupas a presença da enzima fosfatase ácida, por exemplo, essa base evapora não mantendo resíduo na matriz original como no caso do hidróxido de sódio ou do carbonato de sódio que podem ficar em contato com a amostra biológica ocasionando alguma alteração na propriedade da mesma, o que não ocorre com o hidróxido de amônio o que facilita em muito a estocagem dessas amostras como contraprova. Nos casos típicos de vestimentas com tonalidades próximas ao rósea, cor essa semelhante a forma cromófora da fenolftaleína onde a detecção da: enzima por este método possa ser mascarada, optou-se por utilizar uma solução íntensificadora de coloração constituída por solução de sulfato de cobre com concentração 0,5 mol.L-1 que ao se misturar ao tom rósea da fenolftaleína assume um tom lilás contrastante com as colorações originais permitindo sua visualização.    :