Processo de produção de celulase e hemicelulases empregando celulose parcialmente hidrolisada, uso de celulose parcialmente hidrolisada, e, substrato compreendendo celulose parcialmente hidrolisada

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 032972 7 A2
  • Data do depósito:
  • 21/12/2012
  • Data da publicação:
  • 25/06/2013
Inventores:
  • Classificação:
  • C12N 9/42
    Enzimas, p. ex. ligases (6.); Pro-enzimas; Suas composições; Processos para preparar, ativar, inibir, separar, ou purificar enzimas; / Hidrolases (3.); / agindo sobre compostos de glicosila (3.2); / agindo sobre liga??es beta-1, 4-glicos?dicas, p. ex. celulase;
    ;
    C12R 1/80
    Micro-organismos; / Fungos; / Penicillium;
    ;

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CELULASE E HEMICELULASES EMPREGANDO CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA, USO DE CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA, E, SUBSTRATO COMPREENDENDO CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA. A presente invenção se refere a um processo de produção de celulases caracterizado por compreender pré-hidrólise de celulose e inoculação de celulose pré-hidrolisada, açucares liberados da pré hidrolise e cultura de crescimento de Penicillium echinulatum com Penicillium echinulatum.

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Documento

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES EMPREGANDO CELULOSE PARCIALMENTE Hl D RO USADA, USO DE CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA, E, SUBSTRATO

COMPREENDENDO CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de produção de enzimas, especialmente celulases e/ou hemicelulases, utilizando como substrato celulose parcialmente hidrolisada como fonte indutora e de carbono. Em uma realização preferencial, os indutores liberados da hidrólise parcial da celulose são adicionados ao meio de cultivo para obter maiores produções de enzimas e em outra realização, a celulose parcialmente hidrolisada é acrescida ao meio de cultivo. A presente invenção se situa no campo da biologia, química e bioquímica.

Antecedentes da Invenção

As celulases são constituídas por um complexo enzimático constituído por 1) endo-P-1,4-glicanases que hidrolisam as ligações glicosídicas ao acaso na fibra de celulose; 2) exo- p-1,4-glicanases ou celobiohidrolases, que agem nas extremidades redutoras e não redutoras de polímeros gerados pela ação das endoglicanases liberando oligossacarídeos e celobiose; e 3) (3-1,4-glicosidases que hidrolisam oligossacarídeos e celobiose a glicose.

A hidrólise de celulose a glicose tem cada vez mais importância, pois este açúcar pode ser utilizado como matéria-prima em uma série de processos biotecnológicos e químicos. Nas últimas décadas, as tecnologias baseadas na atividade de celulases vêm despertando cada vez mais interesse. A investigação para encontrar substratos adequados para produção de biocombustíveis tais como etanol de segunda geração tem sido de particular interesse. Além disso, a celulose é encontrada em substratos de baixo custo, tais como bagaços, serragens, resíduos da agricultura e no lixo urbano. No entanto, para que a celulose seja hidrolisada faz-se necessário o uso de enzimas (celulases) ou ácidos. A opção enzimática é mais promissora devido ao fato desta gerar menores quantidades de produtos de degradação, além das enzimas não serem corrosivas.

No processo de produção de celulases, a celulose é adicionada ao meio de cultivo para servir como fonte indutora. No entanto, devido ao grande tamanho das fibras de celulose, as quais são constituídas por 8.000 a 12.000 unidades glicopiranosídicas, estas moléculas não são capazes de entrar no interior da célula e acionar o mecanismo de regulação gênica que controla a produção das enzimas do complexo celulases. Assim, celulases constitutivas presentes na parede celular do conídio ou da parede celular, realizam uma hidrólise parcial da fibra de celulose, liberando assim dissacarídeos e monossacarídeos que são capazes de entrar na célula e acionar o mecanismo de produção de celulases. Intracelularmente, monossacarídeos, como a glicose também podem ser convertidos a dissacarídeos por ação de (3-glicosidases.

No entanto, estes dissacarídeos gerados por hidrólise do substrato ou transglicosilação são gerados em pequenas quantidades, o que resulta em produção de enzimas para a manutenção da célula, não incrementando a produção de celulases como se deseja para tornar o processo de produção de celulases rentável economicamente. Neste sentido, uma alternativa é a suplementação do meio de cultivo com estes dissacarídeos. Porém, o uso destes açúcares para produção comercial de celulases torna-se inviável devido aos seus elevados valores, 100 mg de soforose custam R$ 8.410,00 (oito mil quatrocentos e dez reais) enquanto a gentiobiose custa R$ 1.334,00 (um mil trezentos e trinta e quatro reais) por grama.

Assim, como para a produção de enzimas celulases o substrato utilizado é uma forma microcristalina da celulose um produto comercial oriundo da indústria papeleira, o qual apresenta custo em torno de US$ 130/tonelada.

A literatura patentária contempla diversos documentos relacionados à produção de celulases e em alguns casos menciona o emprego dos dissacarídeos gentiobiose, soforose e lactose, no entanto não há relato de emprego de celulose parcialmente hidrolisada como fonte de indutores, conforme apresentado na presente invenção.

O documento US 2011/0262997, depositada pela Novozymes North America, Inc. relata um processo de produção de celulase em célula hospedeira e emprega material lignocelulósico pré-tratado para induzir a produção de celulase. A invenção também se relaciona com a utilização de pré-tratado com o material ligno-celulósico como indutor ou fonte de carbono nos processos de produção de celulase.

O documento intitulado “Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis", US 5,888,800 descreve o aumento da produção de uma celulase heteróloga conseguido através da transformação de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis com construções genéticas que contêm um promotor de protease e da sequência de sinal para expressar genes de celulase alcalofílicas.

O pedido de patente US 2008/0241885 relata a produção de celulases empregando uma cultura microbiana que produz soforolipfdio e a utilização do soforolipídio para a produção de celulases.

O documento intitulado “Method for cellulase production”, US 8,093,019, depositado pela logen Energy Corporation descreve um processo de fermentação usando hemicelulose para produção de misturas de celulase com uma elevada proporção de celulases em relação a hemicelulases. As celulases produzidas pelo processo da invenção são ainda caracterizadas por uma produtividade específica elevada. As misturas resultantes de celulase compreendem pelo menos duas vezes mais do que a celulase, hemicelulase e são úteis para a hidrólise de substrato celulósico, em particular, do substrato pré-tratado lignocelulósico.

A patente US 4,275,163 “Cellulase-producing microorganism” descreve um processo e um microrganismo para a síntese de celulases. O microrganismo empregado é uma estirpe mutante de um fungo ascomiceto capaz de sintetizar celulases. A síntese de celulases pelo mutante não é reprimida por glicerol, reprimido pela glicose e indutíveis na presença de níveis elevados por lactose. Além disso, a combinação de lactose com xilose elicia síntese de celulases pelo mutante.

O documento US 2010/0009408 “Induction of Gene Expression Using a High Concentration Sugar Mixture”, descreve uma composição útil para induzir a expressão de genes cuja expressão está sob controle de uma sequência de promotor indutível e métodos para a preparação composições e utilização. Neste documento são empregados os açúcares celobiose, gentiobiose, soforose e glicose para induzir a produção de celulases.

No documento patentário “Compositions and Methods for Improved Protein Production” US 2010/0279346, são utilizados como indutores para produção de celulases os substratos celulose, lactose, soforose e glicose/soforose.

A patente depositada sob número US 8,044,192 intitulada “Promoters and uses thereof da Rohm Enzyme GmbH, emprega vetores contendo promotores que são ativados por soforose. Estes vetores são inseridos na célula hospedeira por transformação.

A invenção relatada na patente “Method for production of secreted proteins in fungi”, US 2004/0115790, refere-se a um promotor em hospedeiro fúngico para a produção de proteínas. De acordo com a invenção, o promotor foi modificado na sua resposta aos mecanismos que medeiam transcricional da regulação negativa de proteínas secretadas sob stress. Esta invenção relaciona-se também a métodos para a produção de proteína otimizado de proteínas secretáveis em fungos.

A existência de diversas patentes sobre a produção de celulases e hemicelulases, sendo que algumas depositadas por empresas produtoras de enzimas, como Novozymes e logen Energy Corporation, demonstra que há grande interesse comercial por estas enzimas, principalmente devido ao potencial de uso de celulases para produção de biocombustíveis de segunda geração.

A presente invenção descreve uma hidrólise parcial de celulose, empregando baixas concentrações de celulases, para liberar componentes, preferencialmente açúcares, que atuarão como indutores no processo de produção de celulases, incrementando assim os títulos enzimáticos produzidos.

Neste sentido, a presente invenção vem proporcionar uma forma alternativa de indução adicional aos processos de produção de celulases, levando a produção de maiores títulos enzimáticos devido a presença de indutores liberados a partir da degradação da celulose que será empregada nos meios de produção.

A presente invenção apresenta diversas vantagens em relação ao estado da técnica, tais como:

*    o processo utiliza indutores liberados de processos de hidrólise parcial de celulose para a elevada produção das enzimas celulases a baixo custo;

*    o processo permite a utilização da celulose parcialmente degradada para produção de celulases como fonte de carbono e indutora;

*    possibilita maiores produtividades, visto que o emprego de indutores antecipa a produção de celulases;

*    possibilita a obtenção de indutores de baixo custo em relação aos disponíveis no mercado, mais eficientes para a produção de celulases.

O processo de produção de enzimas da presente invenção é uma alternativa aos processos conhecidos, pois, torna a produção mais rentável, visto que emprega o substrato que já é tradicionalmente empregado como fonte de carbono, porém, com a hidrólise parcial da celulose, os títulos enzimáticos são incrementados e os maiores títulos enzimáticos são obtidos em tempos menores.

Do que se depende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo de produção de celulases caracterizado por compreender

-    pré-hidrólise de celulose,

-    inoculação de celulose pré-hidrolisada, açucares liberados da pré hidrolise e cultura de crescimento de Penicillium echinulatum com Penicillium echinulatum.

Em uma realização preferencial o Penicillium echinulatum é de linhagem 9A02S1.

Em uma realização preferencial os açúcares liberados da pré hidrolise são oligo-, di- e monossacarídeos.

Em uma realização preferencial a cultura de crescimento de Penicillium echinulatum compreender cultivos em estado sólido ou cultivos submersos.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve descricão das fiauras

A Figura 1 apresenta as atividades de endoglicanases obtidas em cultivo de Penicillium echinulatum em meio contendo celulose parcialmente hidrolisada em diferentes tempos de hidrólise.

Na Figura 2 são apresentadas as atividades de endoglicanases obtidas em cultivos com Penicillium echinulatum, empregando celulose hidrolisada enzimaticamente durante diferentes tempos. A atividade apresentada no gráfico refere-se a atividade obtida em 48 horas de cultivo. Verifica-se que a produção de endoglicanases na amostra que foi hidrolisada por uma hora foi superior ao cultivo com celulose não hidrolisada.

A Figura 3 apresenta as medidas de pH obtidas durante o cultivo de Penicillium echinulatum contendo hidrolisados de celulose em frascos mantidos sob agitação recíproca. Verifica-se que os meios formulados com celulose parcialmente hidrolisada apresentaram redução no pH anterior ao meio formulado com celulose não tratada enzimaticamente.

Na Figura 4 são apresentados os perfis de bandas de atividade de endoglicanases em gel contendo carboximetiicelulose e em mistura reacional

do caldo enzimático, produzido por Penicillium echinulatum 9A02S1 obtido do cultivo submerso controle, contendo 1% de celulose. A- Perfil da atividade de proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) extraídas e precipitadas a partir de 2 pl do caldo enzimático. M - massa molecular. Na lateral direita encontram-se as informações dos valores da massa molecular. A) celulose não tratada enzimaticamente, B) celulose parcialmente hidrolisada durante 30 minutos, C) celulose parcialmente hidrolisada durante 1 hora. Verifica-se maior quantidade de bandas nas amostras que foram produzidas na presença de celulose parcialmente hidrolisada.

A Figura 5 ilustra os dados obtidos na cromatografia de interação iônica para quantificação dos açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose. A figura A mostra o tempo inicial (tempo zero) e, na figura B, após 1 hora de hidrólise.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o

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Processo de produção de enzimas

A presente invenção descreve o processo de produção de enzimas compreendendo o emprego de celulose parcialmente hidrolisada e açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose.

Em uma realização preferencial, a celulose é parcialmente hidrolisada empregando enzimas hidrolíticas (celulases, xilanases, etc..).

Em uma outra realização preferencial, são empregados os açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose.

Em outra realização preferencial, são empregados os açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose juntamente com a celulose parcialmente hidrolisada.

Em uma realização preferencial, o processo de produção compreende a produção das enzimas em cultivos em estado sólido.

Em outra realização preferencial, o processo de produção compreende a produção em cultivos submersos.

Uso de celulose parcialmente hidrolisada para produção de celulases

A presente invenção também descreve o uso de celulose parcialmente hidrolisada e dos oligo- di- e monossacarídeos liberados da hidrólise da celulose para produção de enzimas, preferencialmente celulases.

P. echinulatum denominada 9A02S1

P. echinulatum denominada 9A02S1, é linhagem mutante de Penicilium echinulatum linhagem 9A02S1, depositada no Centro Depositário DSMZ, na Alemanha, com registro de deppósito número DSM18942. Número de acesso par ao depósito : DSM18942; data de depósito : 17/01/2007; Nome e endereço da instituição depositária: Centro Depositário DSMZ, Alemanha, DSMZ GmBH, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig. A linhagem pode ser facilmente crescida em meio Potato dextrose Agar na temperatura de 28 C.

A presente invenção também descreve um substrato compreendendo celulose parcialmente hidrolisada para produção de enzimas, preferencialmetne celulases.

Exemplo 1. Realização Preferencial

Na presente invenção, foram desenvolvidos processos de produção de celulases empregando celulose parcialmente hidrolisada enzimaticamente ou empregando os oligo-, di- e monossacarídeos liberados da hidrólise da celulose para produção de enzimas. A produção de celulases empregando este substrato pode ser realizada tanto por fungos como por bactérias, em cultivos submersos e/ou em estado sólido. O processo é inovador e visa preencher diversas lacunas encontradas no estudo da técnica, apresentando diversas alternativas para a produção de maiores títulos enzimáticos em menores tempos, empregando substratos (substâncias indutoras) e técnicas de baixo