Processo para produção de mapk e mapk3 recombinante de leishmania e uso no diagnóstico e vacina contra leishmanioses

  • Número do pedido da patente:
  • BR 10 2012 033560 3 A2
  • Data do depósito:
  • 28/12/2012
  • Data da publicação:
  • 23/06/2015
Inventores:
  • Classificação:
  • G01N 33/569
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / para micro-organismos, p. ex. protozo?rios, bact?rias, v?rus;
    ;
    C07K 14/44
    Pept?deos tendo mais de 20 amino?cidos; Gastrinas; Somatoestatinas; Melanotropinas; Derivados dos mesmos; / de animais; de seres humanos; / de protozo?rios;
    ;
    G01N 33/531
    Investiga??o ou an?lise de materiais por m?todos espec?ficos n?o abrangidos pelos grupos ; / Material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Hemocitr?metros; / An?lise qu?mica de material biol?gico, p. ex. sangue, urina; Testes por m?todos envolvendo a forma??o liga??es bioespec?ficas de ligantes; Testes imunol?gicos; / Imuno-ensaio; Ensaios envolvendo ligantes bioespec?ficos; Materiais para os mesmos; / Produ??o de materiais para teste imunoqu?mico;
    ;
    C12N 15/30
    Muta??o ou engenharia gen?tica; DNA ou RNA concernentes ? engenharia gen?tica, vetores, p. ex. plasm?deos ou seu isolamento, prepara??o ou purifica??o; Uso de seus hospedeiros; / Tecnologia do DNA recombinante; / Fragmentos de DNA ou RNA; Suas formas modificadas; / Genes que codificam prote?nas de protozo?rios, p. ex. de Plasmodium, Trypanosoma,Eimeria;
    ;

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE MAPK E MAPK3 RECOMBINENTE DE LEISHMANIA E USO NO DIAGNÓSTICO E VACINA CONTRA LEISHMANIOSES A presente invenção se refere ao uso dos antígenos recombinantes MAPK e MAPK3, proteínas presentes em protozoários do gênero Leishmania, na produção de vacinas e kit diagnóstico contra leishmanioses para seres humanos e/ou cães. Esses antígenos foram selecionados por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. A reação de ELISA com anticorpos anti-MAPK e anti-MAPK3 permitiu identificar corretamente os cães não infectados e os cães infectados. Os resultados obtidos foram validados por testes de referência para diagnóstico de Leismaniose Visceral Canina (LVC) (Kit EIE-LVC - Bio-Manguinhos ^ ^).

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PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE MAPK E MAPK3 RECOMBINANTE DE LEISHMANIA E USO NO DIAGNÓSTICO E VACINA CONTRA LEISHMANIOSES

A presente invenção se refere ao uso dos antígenos recombinantes MAPK e MAPK3, proteínas presentes em protozoários do gênero Leishmania, na produção de vacinas e kit diagnóstico contra leishmanioses para seres humanos e/ou cães. Esses antígenos foram selecionados por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. A reação de ELISA com anticorpos anti-MAPK e anti-MAPK3 permitiu identificar corretamente os cães não infectados e os cães infectados. Os resultados obtidos foram validados por testes de referência para diagnóstico de Leismaniose Visceral Canina (LVC) (Kit EIE-LVC - Bio-Manguinhos®).

As proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina-treonina quinases envolvidas na regulação de uma ampla variedade de respostas celulares (Cross, T. et ai Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Experimental Cell Research, v.256, p.34-41, 2000). As MAPKs transmitem sinais extracelulares captados por receptores de membrana após variados estímulos, inclusive estresse e, através da fosforilação de substratos específicos em resíduos de serina e treonina (SU, B. et ai Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Current Opinion in Immunology, v.8, p.402-411, 1996) essas enzimas podem regular positiva ou negativamente o substrato, modulando, assim, a expressão gênica, mitose, motilidade, metabolismo, proliferação, diferenciação, sobrevivência, interrupção do ciclo celular e apoptose (Wada, T. et ai Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene, v.23, p.2838-2849, 2004).

O projeto genoma de Leishmania revelou que estes parasitos codificam em torno de 197 proteínas MAPKs e MAPKs-//ke kinases (Parsons, M. et ai. Comparative analysis of the kinomes of three pathogenic trypanosomatids: Leishmania major, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. BMC Genomics, v.6, p. 127, 2005), representando aproximadamente 2% do genoma e sugerindo que estas proteínas apresentam importante papel no ciclo biológico do parasito. Algumas dessas proteínas foram previamente identificadas como importantes para mecanismos de virulência do parasito, bem como na biogênese flagelar (Rotureau, B. et al. The flagellum-MAP kinase connection in trypanosomatids: a key sensory role in parasite signaling and development- Cellular Microbiology, v.11, p.710-718, 2009). Adicionalmente, estudos funcionais demonstraram que alterações nas vias que estas proteínas estão envolvidas implicam negativamente na patogenicidade destes parasitos, fato este que torna as MAPKs como possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas (Naula, C. et al. Protein kinases as drug targets in trypanosomes and Leishmania. Biochimica et Biophysica Acta, v.1754, p.151-159, 2005). Neste contexto, o amplo número de proteínas desta família e a alta homologia entre estas proteínas associado à importância delas em estágios evolutivos encontrado no hospedeiro vertebrado, pode ser empregado como estratégia para desenvolvimento de testes de diagnóstico e imunobiológicos vacinais para leishmanioses.

Atualmente, são encontrados no estado da arte alguns documentos descrevendo estudos relacionados à família de proteínas MAPKs, entretanto, são escassos os trabalhos que investigam o padrão de expressão desta família de proteínas MAPK e MAPK3 em parasitos do gênero Leishmania no sentido de identificar o potencial destas proteínas como composto imunogênico para kit diagnóstico e vacinas. Apesar da extensiva busca por imunobiológicos mais sensíveis e específicos para vacinas contra leishmanioses, ainda são necessárias melhorias na eficácia destes métodos em diagnosticar a doença nos principais hospedeiros envolvidos no ciclo de vida do parasito, quais sejam o homem e os cães. Assim, a presente invenção é apresentada como uma alternativa para solucionar este problema. Trata-se do uso da forma recombinante das proteínas MAPK e MAPK3 de Leishmania como antígeno para método diagnóstico e vacinas contra leishmanioses em cães e/ou humanos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral anti-MAPK e anti-MAPK3 de Leishmania (Viannia) braziliensis e do kit

EIE-LVC (Bio-Manguinhos®) em soro de cães de área endêmica para Leishmaniose Visceral Canina. O eixo X representa os grupos avaliados: cães não infectados (Negativo, n = 12) e cães infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi (Positivo, n = 18). Já o eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100.

A Figura 2 apresenta um gráfico comparando as curvas ROC obtidas da ELISA de MAPK e MAPK3. Essas curvas foram utilizadas para determinar o cut off, sensibilidade, especificidade e área abaixo da curva (AUC) da técnica de ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao uso dos antígenos recombinantes MAPK e MAPK3, presentes em protozoários do gênero Leishmania, para diagnóstico e formulação de vacina para as leishmanioses em seres humanos e/ou cães. Esses antígenos foram selecionados por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. De modo geral, sequências de aminoácidos das proteínas dos parasitos Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana foram obtidas do proteoma predito, a partir do banco de dados GeneDB (http://www.genedb.org), onde foi gerado um sub-banco após a exclusão de pseudogenes e genes parciais.

Em seguida, as sequências de proteínas selecionadas anteriormente foram submetidas à análise de similaridade contra sequências do banco de dados ImmunoneBase (http://bioinf.uta.fi/lmmunomeBase/home.html), o qual contém sequências de proteínas intrinsecamente relacionadas ao sistema imunológico do hospedeiro e/ou à defesa contra patógenos (RANNIKKO, K. et ai. Immunity genes and their orthologs: a multi-species database. International Immunology, v.19, p. 1361-1370, 2007), utilizando o algoritmo BLASTP (Basic Local Aligment Search Tool, Disponível em http://www.genbank.nlm.nih.gov). Proteínas apresentando homologia com proteínas de referência depositadas no

ImmunoneBase das espécies Homo sapiens (1375 entradas) e Mus musculus (1181 entradas) foram selecionadas e submetidas ao programa MultiLoc (http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc) para predição de localização celular. Para realizar essa classificação, o programa baseia-se na análise da presença de peptídeo sinal N-terminal, na identificação de domínios conservados, os quais estão presentes em famílias de proteínas com localização celular específica, e na composição de aminoácidos (HÕGLUND, A. et al. Significantly improved prediction of subcellular localization by integrating text and protein sequence data. Pacific symposium on biocomputing, p. 16-27, 2006).

As sequências destas proteínas selecionadas foram analisadas no software Pfam 24.0 (http://pfam.sanger.ac.uk/), o qual contém um amplo banco de dados de famílias e domínios conservados de proteínas, bem como informações sobre as funções biológicas dessas moléculas (PUNTA, M. et al. The Pfam protein families database. Nucleic Acids Research, v. 40, p. 290-301, 2012). A partir dessa análise, foi identificada a presença de domínios protéicos potencialmente capazes de atuar como proteínas de interação (“protein-protein interaction”, 917 entradas) nas sequências, servindo então como critério de seleção de proteínas para serem utilizadas nas etapas seguintes do presente trabalho, dentre elas a MAPK e MAPK3. Todas as análises in silico foram realizadas localmente no servidor do laboratório, onde estão instalados os programas supracitados.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, mas de modo não limitante, com os exemplos a seguir.

Exemplo 1: Clonagem do gene codificador das proteínas MAPK E MAPK3

Primers específicos para a amplificação por PCR (Polimerase Chain Reaction) do gene completo da MAPK e MAPK3 foram desenhados (MAPK: SEQ ID N°1, SEQ ID N°2; MAPK3: SEQ ID N°3 e SEQ ID N°4), de forma a amplificar toda a sua região codificadora. Em relação à MAPK foram inseridos sítios de restrição para Nhel, no primer senso (SEQ ID N°1), e para Xhol no primer antisenso (SEQ ID N°2) nas extremidades 5’ para facilitar a transferência dos amplicons entre os vetores de clonagem (pGEM®-T, Promega) e de expressão (pET28a-TEV). Na MAPK3 foram inseridos sítios de restrição para Nhel no primer senso (SEQ ID N°3) e para BamHI no primer antisenso (SEQ ID N° 4), nas extremidades 5’.

As amplificações por PCR foram realizadas utilizando como molde 20100 ng de DNA genômico extraído de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana, além de tampão de reação comercial, 50-200pM de dNTP, 2-10 ng de cada um dos primers senso (SEQ ID N°1) e antisenso (SEQ ID N°2), e 0,5-1,25 U de Taq polimerase de alta fidelidade, em um volume final de 30-50 pL de reação.

Os amplicons obtidos nas PCRs foram misturados com tampão de amostra de DNA em concentração final de 1X e submetidos à separação em gel de agarose 1%, a 100-200 V, em tampão TAE 1X contendo brometo de etídio.

Após a separação, as bandas com tamanho de 1092 pares de bases (MAPK) e de 1167 pares de bases (MAPK3) foram excisadas do gel. O bloco de agarose contendo os amplicons desejados foi submetido à purificação utilizando um kit comercial. O DNA purificado foi, então, clonado no vetor pGEM®-T, através de incubação por 12-16 horas, a temperatura de 2-8°C, com a enzima T4-ligase, seguindo as instruções do fabricante. Este vetor possui gene de resistência à ampicilina para seleção de transformantes positivos.

Cerca de 1-10 pL dos sistemas de ligação foram incubados por 5-10 minutos no gelo com 50-100 pL de bactérias Escherichia coli eletrocompetentes da cepa XL1-Blue. Após este período, as amostras foram transferidas para cubetas de 0,1 cm e submetidas a um pulso de 2,00-2,50 kV em um eletroporador. Após a eletroporação, foram adicionados 50-300 pL do meio de cultura 2xYT líquido, seguido por incubação durante 1 hora, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). Após este período, as amostras foram plaqueadas em meio sólido 2xYT-ágar 1,5% com ampicilina (20-100 pg/mL). As placas foram colocadas em estufa durante 12-16 horas, para obtenção de colônias isoladas.

Os clones positivos obtidos foram inoculados em 3-10 mL de meio 2xYT, contendo ampicilina e cultivados durante 12-16 horas, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). A extração dos plasmídeos foi realizada utilizando um kit comercial.

Os plasmídeos contendo os insertos (amplicons) foram submetidos a dupla digestão, durante 12-16 horas, a 30-37°C, com as enzimas de restrição Nhel e Xhoi para MAPK e Nhel e BamHI para MAPK3, cujos sítios específicos estão presentes nas extremidades do amplicon. Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese e os insertos obtidos (1092 pb da MAPK e 1167 pb da MAPK3), foram purificados do gel de agarose.

Exemplo 2: Expressão das proteínas MAPK e MAPK3 em E. coli

A ligação entre os fragmentos clonados, obtidos por digestão enzimática dos plasmídeos, conforme descrito no exemplo anterior, e o vetor pET28a-TEV, que também foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Xhol para MAPK e Nhel e BamHI para MAPK3, e possui o gene de resistência à kanamicina para seleção positiva dos transformantes, foi realizada através de suas extremidades coesivas, por incubação a temperatura de 2-8°C, durante 12-16 horas, com a enzima T4 Ligase em tampão comercial específico. Após a incubação, o produto de ligação foi utilizado na transformação de bactérias Escherichia coli, cepa BL-21Star, através de eletroporação.

Colônias isoladas de BL-21Star apresentando o plasmídeo pET28a-TEV que contém o gene que codifica a proteína MAPK e MAPK3 foram inoculadas em 3 ou 20 mL de meio 2xYT líquido contendo kanamicina (10-50 pg/mL) e incubadas por 12-16 horas sob a agitação (180-200 rpm). Após este período, os inóculos foram diluídos 1:20 em 10 ou 400 mL de meio 2xYT contendo kanamicina (10-50 pg/mL) e incubados a 30-37°C, sob agitação (180-200 rpm) até atingirem densidade óptica (DO600) de 0,6-0,8. Em seguida, a expressão das proteínas recombinantes foi induzida através da adição de 0,5-1,0 mM IPTG, sendo as culturas, então, incubadas por 3-12 horas, a 30-37°C e sob agitação (180-200 rpm). Finalizado o tempo, as culturas foram centrifugadas a 3000-6000 rpm, por 10-30 minutos e a 4°C, o sobrenadante foi descartado e o pellet residual foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C. Alíquotas das culturas imediatamente antes da adição de IPTG, e após 3-12 horas de expressão, foram também congeladas para confirmar a expressão das proteínas recombinantes.

Os sedimentos celulares mantidos a -80°C foram descongelados no gelo e ressuspendidos em 5-50 mL de PBS para cada 50-500 mL de cultura inicial, na presença de lisozima (20-100 pg/mL), sendo, então, homogeneizados e deixados em repouso por 15-30 minutos. Após o repouso, as alíquotas foram submetidas a 4-5 ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria à 37°C e passadas exaustivamente em seringas de insulina. As amostras foram centrifugadas por 10 a 30 minutos a 10000-14000 rpm, a 4°C, para separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel (pellet). Amostras destas duas frações foram analisadas em eletroforese gel de poliacrilamida-SDS para avaliar em qual fração a proteína recombinante se encontra. Quando as proteínas se apresentaram insolúveis, foi adicionado ao tampão de ressuspensão 4-8 mol.L'

1 de uréia para torná-las solúveis.

O extrato protéico da fração sobrenadante do teste solubilidade foi aplicado em uma coluna HisTrap HP de 1 mL (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi primeiramente lavada com 5 volumes de coluna com o tampão A (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 30mM). A eluição foi realizada através da adição do tampão B (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 500mM). Todas as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

As amostras obtidas nas expressões e purificações foram submetidas à separação por eletroforese em gel de poliacrilamida, utilizando Bis-acrilamida 40%. Após a corrida, os géis foram corados por incubação por 12-16 horas com a solução de Coomassie Blue e então, descorados em solução etanol 30% e ácido acético 10%.

As proteínas recombinantes purificadas e peptídeos foram analisados em espectrômetro de massas, tipo MALDI, Bruker Daltonic sautoflex III smartbeam.

Exemplo 3: Teste para imunodiagnóstico de leishmaniose

O teste para imunodiagnóstico de leishmaniose pode ser selecionado do grupo compreendendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. A técnica de ELISA foi escolhida na presente invenção por ser menos invasiva, de fácil execução e automação, permitindo estudos e aplicação em grande número de amostras.