Processo de obtenção de nova vacina pertussis celular

  • Número do pedido da patente:
  • PI 0402630-6 B1
  • Data do depósito:
  • 05/07/2004
  • Data da publicação:
  • 07/07/1998
  • Data da concessão:
  • 17/02/2004
Inventores:
  • Classificação:
  • A61K 39/116
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos; / Ant?genos bacterianos polivalentes;
    ;
    A61K 39/10
    Prepara??es medicinais contendo ant?genos ou anticorpos; / Ant?genos bacterianos; / Brucella; Bordetella, p. ex. Bordetella pertussis;
    ;

"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NOVA VACINA PERTUSSIS CELULAR". Que prevê a utilização de células de Bordetella pertussis, obtidas por cultivo em fermentador, destoxificadas por formaldeído, que após tratamento com solvente orgânico originam preparações vacinais menos tóxicas e tão potentes quanto a vacina pertussis celular tradicional.

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Documento

"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NOVA VACINA PERTUSSIS CELULAR"


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Objetivo:    Refere-se o presente invento ao

desenvolvimento de uma vacina pertussis celular que, obtida

através do referido processo, se apresenta menos tóxica e

i v    ■    ■

5 tão potente quanto a vacina pertussis celular tradicional.

Estado da Arte: A coqueluche, também conhecida como pertussis ou "tosse cumprida" é uma doença infecciosa no trato respiratório superior, causada por uma bactéria, a Bordetella pertussis. De acordo com a Organização Mundial 10 da Saúde, essa doença acomete anualmente cerca de 60 milhões de crianças, sendo responsável por 600.000 mortes, principalmente em paises subdesenvolvidos ou em vias de desenvolvimento, com condições sanitárias precárias ou deficiências nos programas de vacinação.

15    A vacina pertussis celular foi descrita na década

de 1940, por Kendrick e colaboradores. É uma vacina preparada com células bacterianas obtidas a partir de centrifugação ou filtração da cultura em meio liquido, submetida à inativação por formaldeido, timerosal ou 20 tratamento térmico. A imunização com tal vacina tem sido mundialmente aceita, com alta eficácia no controle da doença. Embora sejam muito eficientes e levem à cobertura vacinai, a destoxificação das preparações vacinais é um dos pontos cruciais do processo de produção, tendo sido 25 dèscritos efeitos colaterais indesejáveis, por vezes de ' gravidade considerável.

Isso


levou


ao


desenvolvimento das


vacinas


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acelulares, menos tóxicas, compostas pelos principais elementos antigênicos da bactéria. Essas preparações, em sua maioria, diferem entre si qualitativa e/ou quantitativamente quanto aos componentes antigênicos utilizados, uma vez que a formulação final ainda não está totalmente definida. Seja qual for a formulação escolhida pelo produtor, na maioria das vezes o valor agregado do produto final é alto, uma vez que normalmente são exigidas várias etapas de purificação, por vários processos de cromatografia, à partir de sobrenadantes ou filtrados de cultivo, para obtenção de cada um dos componentes da vacina, em sua maioria excretados no meio de cultura.

Descrição da Invenção: O presente invento refere-se ao "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NOVA VACINA PERTUSSIS CELULAR", a partir de células de Bordetella pertussis tratadas por solvente orgânico.

Para tanto, dito processo prevê as seguintes etapas:    1) cepa liofilizada de Bordetella pertussis 137 é

ressuspensa em Solução Salina 0,85%, semeada em tubos de Bordet-Gengou e incubada a 35°C durante 72 horas; 2) os cultivos são transferidos para outros tubos contendo meio de Bordet-Gengou e incubados a 35°C por mais 24 horas; 3) os crescimentos bacterianos são inoculados em erlenmeyers de 500mL com lOOmL de meio Stainer-Scholte modificado e mantidos a 35°C com agitação a 150 rpm; 4) após 24 horas, este cultivo é inoculado em pré fermentador (150 litros) contendo 60 litros de meio de cultura; 5) após 20 horas a

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35°C, 40 litros do cultivo é transferido para o fermentador de 750 litros com 400 litros do meio ou 60 litros para fermentador de 1000 litros com 600 litros do meio; 6) após 20 horas a 35°C o cultivo de Bordetella pertussís é 5 submetido a filtração tangencial (0,22pg) de forma a se obter a biomassa de Bordetella pertussis que é destoxifiçada com formol 0,2%; 7) as células de Bordetella pertussis destoxifiçadas por formaldeido (100    -    250

unidades opacimétricas/mL) são centrifugadas a 8000 rpm,

10    durante    1. hora    a    4% ou concentradas por filtração

tangencial(0,22 pg) ;    8) a massa úmida celular, na

concentração de lg/20mL de solvente 9%, é mantida sob agitação durante    1    hora a temperatura ambiente; 9) a

suspensão é centrifugada a 8000rpm, durante 1 hora a 4°C ou 15 concentrada por filtração tangencial; 10) o precipitado é lavado    com solução    salina 0,9% (Ig precipitado/lOmL de

salina), seguido de nova centrifugação como descrito acima ou por filtração tangencial (0,22pm);    11) o precipitado

final é ressuspenso em salina tamponada com fosfato, pH 20    6.8, e    constitui    a    vacina pertussis celular tratada com

solvente orgânico (VPL) .

Foram realizadas avaliações em três lotes experimentais de VPL, :    -

Lote

UOp/mL

Vol.(mL)

UOp/total

pH

63/03

110

1974

217 400

6,9

05/04

240

2000

480 000

7,2

72/03

190

2000

380 000

7,3

25 UOp = unidades opacimétricas.

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Esses lotes experimentais de VPL foram avaliados pela Requerente    por Testes de Pirogênio, Potência,

Toxicidade Especifica e Dermonecrótico, resumidamente descritos a seguir.

Teste de pirogênio, realizado para determinar e quantificar a presença de endotoxinas bacterianas em amostras de Vacina pelo Método Qualitativo Gel Clot.

Teste de Potência, realizado em camundongos suiços, de 14-16g, os quais foram imunizados por via intraperitoneal, (0,5 mL/dose), com diluições da vacina teste ou com Vacina Pertussis de Referência. Após 14 dias, os animais foram desafiados, por via intracerebral, com cepa    virulenta    de Bordetella pertussis ATCC 18323

(0,03mL/dose; na diluição 1/3000 de uma suspensão bacteriana de lOUOp/mL). Os animais que morrerem até 72 horas após o desafio foram excluidos da prova. Os animais foram observados diariamente por 14 dias, registrando-se o número de mortos dos grupos teste, em relação aos injetados com diluições da vacina pertussis de referência.

Prova de Toxicidade Especifica, onde a amostra foi inoculada por via intraperitoneal (0,5mL, 20UOp/mL), em camundongos suiços. 0 produto foi considerado satisfatório quando:    no final das 72h, o peso total de cada grupo de

camundongos albinos suiços, susceptiveis, não foi menor que seu peso inicial; no final do 7o dia, a média de ganho de peso do grupo inoculado com a amostra não foi menor que 60% da média de ganho de peso do grupo controle negativo,

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injetado com solução fisiológica; sobreviveram mais que 95% dos animais inoculados com a amostra.

Prova de Toxicidade Dermonecrótica, realizada por inoculação da amostra teste em camundongos lactentes (0,05 5 mL da amostra a 40 UOp/mL) , por via subcutânea. Os animais foram observados após 24h e 48h.    0 produto é considerado

aprovado neste teste quando nenhum dos animais inoculados apresenta mancha escura no local da inoculação. Estimou-se o número de doses de vacina experimental, comparativamente 10 às doses obtidas com o mesmo número de células da vacina celular pertussis tradicional.

Os resultados dos testes de pirogênio, de potência, de toxicidade especifica e de dermonecrótico em Vacina Pertussis Celular tratada com solvente orgânico (VPL) e em 15 Vacina Pertussis Celular Tradicional encontram-se na tabela abaixo, bem como o resumo dos experimentos 63/03,    05/04 e

72/03 da Coleta Individual Inativada de Bordetella pertussis tratada com solvente orgânico.

Lote

Potência UT/dose

Pirogênio (EU/mL)

Toxicidade

Específica

DNT

VT

vpl

VT

VPL

VT

VPL

VT

VP t

63/03

5,33

6,04

> 125.000

>12.500

<25.000

atóxica

atóxica

atóxica

atóxica

05/04

4,34

10,03

> 125.000

>12.500

<25.000

atóxica

atóxica

atóxica

atóxica

72/03

4,34

NT

> 125.000

>12.500

<25.000

atóxica

atóxica

atóxica

atóxica

20 UI = unidades internacionais EU = unidades de endotoxina DNT = teste dermonecrótico VT = Vacina Tradicional

VPL = Vacina Nova NT = não testado

. A presente vacina foi também re-avaliada, pela Requerente, em camundongos, quanto à atividade imunogênica, por indução de anticorpos séricos anti- tóxica pertussis e efeito protetor contra desafio intracerebral com cepa virulenta de Bordetella pertussis 18323.

Grupos de camundongos suiços (14-16g) foram imunizados, por via intraperitoneal (0,5mL/dose) com VP(3U0p/dose); vacina triplice bacteriana (Difteria-tétano-pertussis), produzida pela Requerente (DTP - 1/8 da dose humana) ou solução fisiológica. Após 14 dias, os animais foram sangrados, por punção retro-orbital e os soros avaliados, por ensaio imunoenzimático (ELISA), quanto ao titulo de anticorpos anti-toxica pertussis. Esta avaliação de anticorpos IgG anti-toxica pertussis (PT) em soro de animais imunizados está representada na Figura 1.

No dia seguinte à sangria, os animais foram desafiados, por via intracerebral, com cepa virulenta de Bordetella pertussis 18323, como descrito acima, no teste de potência. A vacina teste (VPL) foi comparada à DTP e ao grupo controle negativo, injetado com salina. 0 teste de desafio intracerebral com cepa virulenta de Bordetella pertussis, em animais imunizados com vacina pertussis celular tratada com solvente orgânico (VPL) está ilustrado na Figura 2.

A nova vacina, obtida através do processo objeto da


5


presente patente, mostrou-se atóxica, tão potente quanto a vacina tradicional, bem como com reduzida taxa de pirogênio em relação à esta. Mostrou-se também imunogênica, desencadeando uma resposta humoral em camundongos, com altos titulos de anticorpos séricos anti-toxina pertussis e com elevado efeito protetor in vivo.

10


E adicionalmente, mostrou-se compatível com outros produtos visando o preparo da vacina quádrupla (difteria, pertussis, tétano e haemophylus ou difteria, pertussis, tétano e hepatite) e pentavalente (difteria, pertussis, tétano, hepatite e haemophylus).

15


Os testes realizados em laboratório pela Requerente atestam que a vacina pertussis obtida pelo presente processo, é uma preparação potente e inócua, contendo as mesmas características antigênicas da vacina celular tradicional por ela também produzida.

A simplicidade técnica deste processo implica em redução do pirogênio da vacina celular e manutenção da potência da vacina, sem acarretar encarecimento ou dificultar o processo já padronizado para a vacina tradicional. A produção de vacina celular contra coqueluche, menos tóxica e com manutenção do baixo custo, terá um grande impacto na Saúde Pública Nacional.

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REIVINDICAÇÃO

Ia) "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NOVA VACINA PERTUSSIS

CELULAR", caracterizado pelo fato de que utilizar células de Bordetella pertussis obtidas em cultivo em fermentador, as quais são destoxifiçadas por formaldeido e tratadas com solvente orgânico, e pelo fato prever as etapas de: 1) cepa liofilizada de Bordetella pertussis 137 é ressuspensa em

Solução Salina 0,85%, semeada em tubos de Bordet-Gengou e incubada a 35°C durante 72 horas; 2) os cultivos são transferidos para outros tubos contendo meio de Bordet-

Gengou e incubados a 35°C por mais 24 horas; 3) os crescimentos bacterianos são inoculados em erlenmeyers de 500mL com lOOmL de meio Stainer-Scholte modificado e mantidos a 35°C com agitação a 150 rpm; 4) após 24 horas,

esse cultivo é inoculado em pré fermentadores    (150

litros) contendo 60 litros de meio de cultura; 5) após 20

horas a 35

°C,

40

litros

do

cultivo é transferido

no

fermentador

de

750

litros

com

40 litros de meio ou

60

litros para

o

fermentador

de

1000 litros contendo

600

litros de meio; 6) após 20 horas a 35°C, o cultivo de Bordetella pertussis é submetido a filtração tangencial (0,22pg)de forma a se obter a biomassa de Bordetella pertussis que é destoxif içado com 0,2% de solução de formaldeido; 7) as células de Bordetella pertussis destoxifiçadas por formaldeido (100-250 unidades opacimétricas/mL) são centrifugadas a 8000rpm, durante 1 hora a 4°C ou concentradas por filtração tangencial

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/    (0,22pm);    8) a massa úmida celular, na concentração de

lg/20mL de solvente 9%, é mantida sob agitação durante 1 hora a temperatura ambiente; 9) a suspensão é centrifugada a 8000rpm, durante 1 hora a 4“C ou concentrada por 5 filtração tangencial; 10) o precipitado é lavado com solução salina 0,9% (lg precipitado/lOmL de salina), seguido de nova centrifugação como descrito acima ou por filtração tangencial (0,22pm);    11) o precipitado final é

ressuspenso em salina tamponada com fosfato, pH 6.8, e 10 constitui o produto final, ou seja, a nova vacina pertussis celular, tratada com solvente orgânico (VPL) -2a)    "PROCESSO    DE    OBTENÇÃO    DE    NOVA    VACINA    PERTUSSIS

CELULAR", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de minimizar a concentração de lipopolissacarideo 15 bacteriano (LPS) na preparação final, resultando numa vacina menos tóxica.

3a)    "PROCESSO    DE    OBTENÇÃO    DE    NOVA    VACINA    PERTUSSIS

CELULAR", de

acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de 20 manter a atividade imunogênica da preparação vacinai tradicional, resultando numa vacina tão potente quanto a vacina celular tradicional.

4a)    "PROCESSO    DE    OBTENÇÃO    DE    NOVA    VACINA    PERTUSSIS

CELULAR", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 25 pelo fato de manter a atividade imunogênica e ser compativel com outros produtos visando o preparo da vacina quádrupla (difteria, pertussis, tétano e haamophylus ou

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difteria,

(difteria,


pertussis, tétano e hepatite) e pentavalente

pertussis, tétano, hepatite e haemophylus).

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FIG. 1

IgG anti-PT (média dos títuios/grupo)


FIG. 2

Teste de desafio intracerebral

Número de animais sobreviventes



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Dias



RESUMO

"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NOVA VACINA PERTÜSSIS CELULAR",

que prevê a utilização de células de Bordetella pertussís, obtidas por cultivo em fermentador, destoxifiçadas por 5 formaldeido, que após tratamento com solvente orgânico originam preparações vacinais menos tóxicas e tão potentes quanto a vacina pertussis celular tradicional.